Способ определения концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом

(51) 01 33/50 (2011.01) 01 33/538 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ исследование проб любых биологических жидкостей, проведение очистки проб от примесей,подкисление фосфорной кислотой с применением катионообменного сорбентаМСХ 96 30, экстракцию на картридже твердофазной экстракции, который промывают 1 мл ацетонитрила,уравновешивают 1 мл дистиллированной воды,после чего наносят 1 мл пробы на картридж твердофазной экстракции и промывают 2-3 мл дистиллированной воды, затем наносят 1 мл раствора элюента, содержащего 50 мл этанола 1 мл 5 4, элюент собирают в емкость для сбора,полученный раствор используют для последующего хроматографирования и определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов. Предлагаемый способ повышает чувствительность определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда в крови и моче, что приводит к увеличению достоверности получаемых результатов концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда, позволяет своевременно проводить коррекцию терапевтической дозы противотуберкулезных препаратов, увеличивает эффективность лечения и уменьшает частоту появления резистентных форм микобактерий туберкулеза.(72) Абилдаев Тлеухан Шилдебаевич Аленова Арике Хамзовна Туткышбаев Серик Оспанович Аманжолова Лайля Кусаиновна Карабалин Арман Балтабаевич Сартаева Гульнур Шыныбековна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПЕРВОГО РЯДА У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом. Способ определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом включает Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом. Химиотерапия - метод лечения инфекционных болезней с помощью химических агентов - основа терапии туберкулза. Целью химиотерапии является достижение желаемого лечебного действия при минимальных побочных эффектах. Рациональный подход состоит в объединении принципов фармакокинетики и фармакодинамики для выявления связи между дозой и эффектом. Фармакодинамика характеризует зависимость концентрация-эффект, тогда как фармакокинетика имеет дело со связью дозы и концентрации( ,./, 8 ., 1990.). Для исследований и фармакодинамика,и фармакокинетика использует измерение концентрации химиотерапевтических средств в биологических жидкостях, с целью прогноза их концентрации в органах мишенях. Точное и достоверное определение последней - важнейший фактор успеха фармакокинетичекого и фармакодинамического исследования, которое, в свою очередь, зависит от выбора метода измерения( ,,. 1985). Кроме того,Стандартная доза химиотерапевтического средства определяется клиническими испытаниями на здоровых добровольцах и пациентах со средней способностью к всасыванию, распределению и элиминации лекарства. Эта доза не подходит для каждого больного. Некоторые физиологические особенности(созревание функции органов у детей) и патологически процессы (сердечная и почечная недостаточность) диктуют необходимость поправок в индивидуальные режимы дозирования. Таким образом,разработка и усовершенствование способов определения концентрации лекарственных препаратов у больных туберкулезом является актуальной задачей фтизиатрии. Известен способ определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом, включающий исследование сыворотки крови с осаждением белков в две стадии 10 24 в воде, а затем метанолом,с последующим определением концентрации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).(Мирошниченко, И. И., Тюняев, И.И., Зуев, А.П. Биодоступность лекарственных средств. - М. Издво Прометей, 2003. - с. 91). Недостатком данного способа является неполная очистка пробы, в результате чего снижается чувствительность способа. Известен способ определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда (изониазида, пиразинамида и 2 рифампицина) у больных туберкулезом,включающий исследование сыворотки крови с дериватизацией с 2-флюоренкарбоксиальдегидом, с экстракцией препаратов смесью этанола с хлороформом (21) и последующим определением концентрации методом ВЭЖХ.,// . . - 2002. .766. - . 357-363.). Недостатком данного способа является длительность подготовки пробы с реакцией дериватизации с 2-флюоренкарбоксиальдегидом, с последующей жидко-жидкостной экстракции. Задачей изобретения является разработка более быстрого, чувствительного и селективного метода определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда в крови и моче. Техническим результатом способа является повышение чувствительности определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда в крови и моче, что приведет увеличению достоверности получаемых результатов концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда, что в свою очередь позволит своевременно проводить коррекцию терапевтической дозы противотуберкулезных препаратов, увеличить эффективность лечения и уменьшить частоту появления резистентных форм микобактерий. Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом, включающий исследование сыворотки крови,экстракцию препаратов с последующим определением концентрации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,отличительной особенностью, согласно изобретению, является то,что определение концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда осуществляют в пробах любых биологических жидкостей, проводят очистку проб от примесей,подкисление фосфорной кислотой с применением катионообменного сорбента 96 30, а экстракцию осуществляют на картридже твердофазной экстракции, который промывают 1 мл ацетонитрила, уравновешивают 1 мл дистиллированной воды, после чего наносят 1 мл пробы на картридж твердофазной экстракции и промывают 2-3 мл дистиллированной воды, затем наносят 1 мл раствора элюента, содержащего 50 мл этанола 1 мл 5 4, элюент собирают в емкость для сбора, полученный раствор используют для последующего хроматографирования и определения концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов. Особенностью предлагаемого способа является то, что данная уникальная методика подготовки проб позволяет определить концентрацию изониазида, пиразинамида и рифампицина в пробах любых биологических жидкостей, например крови,мочи, гноя, спинно-мозговой жидкости и.д. Способ осуществляется следующим образом Для постановки хроматографического анализа производят забор венозной крови без гепарина в количестве 5 мл. Затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Нижнюю фракцию откидывают и используют только супернатант. Подготовка проб сыворотки крови и мочи к 1 мл пробы добавляют 3000 мкл фосфорной кислоты. Картриджи твердофазной экстракцииМСХ 9630(30) устанавливают в позицию холдера-держателя. Включают вакуумный насос и промывают 1 мл ацетонитрила,затем уравновешивают 1 мл. дистиллированной воды. Не отключая вакуумный насос, наносят 1 мл пробы на подготовленный картридж твердофазной экстракцииМСХ 96-30(30) и промывают 2-3 мл дистиллированной воды. Отключив вакуумный насос, удаляют картридж из холдера-держателя,снимают верхнюю металлическую часть и устанавливают емкость для сбора элюента. Вновь собирают холдер-держатель. Устанавливают картридж на место. Затем аккуратно наносят 1 мл раствора элюента (50 мл этанола 1 мл 5 4) и собирают элюент в емкость для сбора. Полученный раствор используют для последующего хроматографирования и анализа. Образец анализируют в течение не более 2 часов. Хроматографическая система Высокоэффективный жидкостный хроматограф, оснащен ультрафиолетовым детектором,способен настраиваться на длину волны 238-нм, с колонкой длинной 250 мм х 4,6 мм, упакован 5 мкм сорбентом обращенной фазы (С 8). Скорость потока 1 мл/мин. Режим разделения изократический, подвижная фаза ацетонитрилл буферный раствор рН 6,8 (4060). Процедура разделения Отдельно вкалывают по 10 мкл стандарта, и определяемого образца в хроматограф, записывают хроматограммы и измеряют площади пиков стандартов. Вычисляют количество мг изониазида, пиразинамида и рифампицина в образце по следующей формуле 100 Где С - концентрация в мг/мл референсного стандартаи- площадь пика образца и стандарта. Клинический пример. Больной О.Ж., 55 лет, поступил в костнохирургическое отделение НЦПТ МЗ РК 24.02.11 с жалобами на боль в области поясницы,усиливающуюся при движении, слабость в ногах,потерю веса в течение года 7-8 кг. Из анамнеза болезни Больной туберкулезный контакт отрицает, туберкулезом ранее не болел. Боли в спине появились весной 2010 года,постепенно нарастали. Получал лечение по поводу остеохондроза, которое было малоэффективным. МРТ позвоночника 09.12.2010 г. выявило признаки туб. Спондилита 11-12. Был госпитализирован во внелегочное отделение ОПТД г. Петропавловск 13.12.2010 г. Взят на 3 11-12,осложненный паравертебральным натечным абсцессом,спондилитическая фаза, стадия разгара, 1 категория. С 14.12.2010 г. начато лечение по 1 категории ДОТС по схеме 2 7 (Н-0,3 -0,6 -2,0 1,2), переносимость специфических препаратов относительно удовлетворительная отмечался легкий кожный зуд, который купировался тавегилом(1 таблетка на ночь). Лечение проводилось с соблюдением ортопедического режима, на фоне обезболивающих средств, витаминотерапии. После заочной консультации больной вызван на оперативное лечение в Национальный центр проблем туберкулеза, где 11.03.11 проведено оперативное вмешательство абсцессотомия,нейрэктомия тел 11-12. Из анамнеза жизни вирусный гепатит и кожновенерологические заболевания отрицает. Аллергоанамнез и наследственность не отягощены. Больной 5 лет назад перенес травму перелом ключицы и 4 ребра справа. Вредных привычек нет. За последние 6 месяцев гемотрансфузий не было.Общее состояние больного при поступлении средней тяжести, за счет болевого синдрома. Сознание ясное, адекватное. Кожа и слизистые бледные, тургор кожи снижен. Периферические лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. ЧД- 18 в мин. Сердечные тоны ясные, ритмичные, пульс - 87 уд/ мин, АД - 100/60 мм.рт.ст. Живот мягкий,безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Мочеиспускание свободное. Стул регулярный.мышцы спины напряжены,отмечается высокое стояние остистых отростков на уровне 11-12. При осевой нагрузке отмечается болезненность. Чувствительность и движение в нижних конечностях сохранены. Функции малого таза не нарушены. МРТ - органов забрюшинного пространства от 09.12.2010 г. признаки туберкулезного спондилита 11-12,осложненного натечными паравертебральными абсцессами. На рентгенографии грудного отдела позвоночника от 13.12.2010 г. - в 2-х проекциях суставная щель 11-12 не дифференцируется,значительно снижена высота тел 11-12, за счет разрушения, на фоне тел очаги литических дестркуций, на уровне поврежденных позвонков тень натечного абсцесса. Обзорная рентгенограмма органов грудной клетки от 25.02.11 г. очаговый фиброз в верхней доле правого легкого. Общий анализ крови от 25.02.11 эритроцитов 3,91012, гемоглобин -116 г/л, ЦП - 0,9, лейкоцитов 5,5109, сегментоядерных - 71, лимфоцитов -20,моноцитов - 9, СОЭ - 16-43 мм/час. Биохимия крови от 24.02.11 билирубин - 8,8 ммоль/л, трансаминаза -0,85 ммоль/л, тимолова проба - 2,0 ЕД, сахар крови - 3,98 ммоль/л, мочевина крови - 3,4 ммоль/л, общий белок - 72 г/л. Общий анализ мочи от 25.02.11 - цвет светложелтый, реакция - кислая, уд. Вес - 1021,прозрачность полная, белок - отсутствует, пл. эп. 3-4, лейкоцитов - 5-6, соли мочевой кислоты,слизь . Бактериоскопия мокроты при поступлении(трехкратно) отрицательная. Бактериологический посев при поступлении - отрицательный. На основании клинико-рентгенологических и лабораторных данных установлен клинический диагноз Туберкулезный спондилит 11-12,активная стадия, осложненный внутригрудным абсцессом, 1 категория, новый случай. По предлагаемому способу у больного О.Ж. было проведено определение концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов первого ряда в сыворотке крови. Для чего полученную пробу очистили от примесей, провели подкисление фосфорной кислотой с применением катионообменного сорбента 96 30. Экстракцию осуществляли на картридже твердофазной экстракции, который промыли 1 мл ацетонитрила, уравновесили 1 мл дистиллированной воды, после чего нанесли 1 мл пробы на картридж и промыли 2-Змл дистиллированной воды. 1 мл раствора элюента, поместили в емкость для сбора,полученный раствор использовали для хроматографирования. Получили следующие концентрации лекарственных противотуберкулезных препаратов(фиг.1, 2). На хроматограмме пациента О.Ж. пики пиразинамид/изониазид выходят на 6,216 и 10,48 мин соответственно. Разрешение между пиками более 2, следовательно, пики расценены как разделившиеся. Коэффициент разделения К для пиразинамида/изониазида равен 3 и 5 соответственно, что говорит об эффективном разделении. На хроматограмме пациента О.Ж. пик рифампицина выходит на 8,507 мин. Коэффициент разделения К для рифампицина равен 4, что говорит об эффективном разделении. Как видно на представленной диаграмме у больного О.Ж. максимальная концентрация изониазида, пиразинамида и рифампицина была выше заданной производителем ПТП нормы и терапевтической концентрации, что очевидно свидетельствует об индивидуальной особенности пациента и может привести к усилению токсической реакции на препараты. Расчет корректирующей дозы был проведен по общепринятой формуле расчета стационарной концентрации. Через 10 дней при достижении новой стационарной концентрации было проведено дополнительное фармакокинетическое исследование, с целью подтверждения правильности проведенной корректировки дозы ПТП. Результат исследования представлен на диаграмме 4. Как видно на представленной диаграмме у больного О.Ж. после корректировки максимальная концентрация и время достижения максимальной концентрации изониазида,пиразинамида и рифампицина установилась в пределах заданной производителем ПТП нормы. Клиренс препарата соответствовал величине,описанной производителем. Для данного больного снижение дозы ПТП, учитывая его индивидуальные особенности организма,вызвало снижение концентрации ПТП в крови до терапевтической концентрации. Таким образом, мониторинг концентрации ПТП в крови пациентов, дает возможность коррекции и индивидуального подбора дозы лекарственного средства,что,несомненно,увеличивает эффективность терапии, снижает частоту случаев приобретенной лекарственной устойчивости, и соответственно значительно сокращает время пребывания пациента на больничной койке и обеспечивает экономию бюджетных средств. В клинике Национального центра проблем туберкулеза было проведено сравнительное исследование у 16 впервые выявленных больных костно-суставным туберкулезом и 6 впервые выявленных больных туберкулезом легких. Половина больных из выборки были обследованы по известному способу,половина по предлагаемому способу. Результаты представлены в таблице. Таблица Результаты исследования сыворотки крови, полученного различными способами Из данных таблицы видно, что при обследовании больных по предлагаемому способу предел количественного обнаружения выше для изониазида в 20 раз, для пиразинамида в 5 раз, для рифампицина в 3 раза, чем при использовании известного способа, при этом линейность и точность увеличивается почти в два раза. У 11 обследованных способом-прототипом впервые выявленных больных туберкулезом, фенотип ацетилирования не возможно было определить, так как точность способа не позволяла достоверно определить концентрацию изониазида в сыворотке крови. Кроме того наблюдалось существенное влияние состава сыворотки крови на точность измерения всех трех противотуберкулезных препаратов при использовании способа-прототипа. В отличие от способа-прототипа предложенный способ имеет стадию отчистки и дополнительной экстракции на твердофазных носителях, что позволяет точно и достоверно определить концентрацию ПТП. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда у больных туберкулезом,включающий исследование сыворотки крови, экстракцию препаратов с последующим определением концентрации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,отличающийся тем, определение концентрации противотуберкулезных препаратов первого ряда осуществляют в пробах любых биологических жидкостей, проводят очистку проб от примесей,подкисление фосфорной кислотой с применением катионообменного сорбентаМСХ 96 30, а экстракцию осуществляют на картридже твердофазной экстракции, который промывают 1 мл ацетонитрила, уравновешивают 1 мл дистиллированной воды, после чего наносят 1 мл пробы на картридж твердофазной экстракции и промывают 2-3 мл дистиллированной воды, затем наносят 1 мл раствора элюента, содержащего 50 мл этанола 1 мл 5 4, элюент собирают в емкость для сбора, полученный раствор используют для последующего хроматографирования и определения концентрации противотуберкулезных препаратов.