Антивирусное средство растительного происхождения

(51) 61 36/36 (2009.01) 61 31/12 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения в качестве антивирусного средства растительного происхождения, обладающего вирусингибирующей активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа используют лиофильно высушенный малотоксичный сапонинсодержащий препарат,полученный из растенияпутем спиртовой экстракции с последующим фракционированием хроматографией высокого давленияи лиофильным высушиванием,при содержании сапонинов в конечном продукте не менее 70 от сухой массы препарата. Положительный эффект преимущества предлагаемого антивирусного средства перед существующими заключаются в большей эффективности действия по сравнению с коммерческими антивирусными препаратами против различных штаммов вируса гриппа, низкой токсичности, отсутствии резистентности у вирусов гриппа к новому антивирусному средству,доступности сырья для получения препарата. Предлагаемое антивирусное средство выделено из растения флоры Казахстана, позволяет расширить арсенал противогриппозных препаратов, и может быть использовано в качестве импортозамещающего противовирусного препарата.(72) Богоявленский Андрей Павлинович Березин Владимир Элеазарович Зайцева Ирина Алексеевна Коротецкий Илья Сергеевич Алексюк Павел Геннадьевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 9514, кл. С 07 307/93, 2000(54) АНТИВИРУСНОЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ(57) Использование медицина, в частности,вирусология,а именно разработка новых противовирусных препаратов Цель применение в медицинской и ветеринарной практике препарата, полученного из растения в качестве малотоксичного антивирусного средства растительного происхождения,эффективно ингибирующего размножение различных штаммов вируса гриппа. Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, а именно разработке новых противовирусных препаратов. Грипп и другие ОРЗ остаются самыми распространенными инфекциями из-за уникальной изменчивости возбудителей и глобального характера эпидемий. По данным ВОЗ заболевания,обусловленные вирусом гриппа, занимают первое место (35,8) среди причин смертности от вирусных инфекций. В качестве лечебных средств против вируса гриппа используются синтетические химиопрепараты и вещества растительного происхождения. Наиболее известным синтетическим лекарственным противогриппозным средством является гидрохлорид -метил-1 адамантилметиламина(ремантадин). Препарат обладает противовирусной активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа А.(Лекарственные средства,применяемые в медицинской практике в СССР/ под ред. М.А.Клюева.- ММедицина.-1991.-512 с). Однако,длительное использование ремантадина в медицинской практике, привело к появлению большого количества устойчивых к нему штаммов вируса гриппа, вследствие чего применение данного препарата стало малоэффективным. Известен ингибитор нейраминидазной активности тамифлю,обладающий противовирусной активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа (патент 5763483. фирмапо лицензии. .353..94404). Использование тамифлю в медицинской практике, привело к появлению большого количества устойчивых к нему штаммов вируса гриппа,вследствие чего применение данного препарата стало малоэффективным. Известен ингибитор гемагглютинирующей активности - аналог изоникотиповой кислоты амизон, обладающий противовирусной активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа(патент 6752). Однако, данный препарат,обладает относительно низкой активностью в отношении вируса гриппа. Известен сесквитерпеновый лактон гвайанового ряда, выделенный из экстрактов растения),обладающий антивирусной активностью по отношению к вирусу гриппа и вирусу болезни Ньюкасла (Бердин А.Г., Адекенов СМ. патент РК 9728). Однако данный препарат является токсичным,обладает относительно низкой активностью в отношении вируса гриппа и малодоступен для использования в нашей стране. Известно антивирусное средство растительного происхождения биологически активный флавоноидный агликон, выделенный из растения. Данный препарат получают с помощью переэкстракции надземной части растения серным эфиром и последующим разделением на колонке с силикагелем. Флавоноидный агликон 2 обладает антивирусной активностью в отношении вируса гриппа (Адекенов СМ., Кульмагамбетова Э.А., Прибыткова Л.Н. патент РК 9514). Вместе с тем, эффективность данного препарата является относительно невысокой,вирусингибирующее действие проявляется не ко всем исследованным штаммам вируса гриппа. Последний препарат растительного происхождения является наиболее близким аналогом по отношению к заявляемому антивирусному средству. Таким образом, известные антивирусные средства обладают рядом недостатков - они являются недостаточно эффективными,малодоступными или токсичными, что снижает возможность их применения в медицинской практике. Вследствие этого, имеется необходимость разработки новых более активных, малотоксичных препаратов, к которым не имеется устойчивости со стороны штаммов вируса гриппа. Целью изобретения является создание нового малотоксичного антивирусного средства растительного происхождения, эффективного в отношении различных штаммов вируса гриппа. Данная цель достигается путем получения растительного препарата в виде лиофильно высушенной фракции выделенной из сапонинсодержащего экстракта растения. Сущность изобретения заключается в получении спиртового экстракта из растения с последующим фракционированием экстракта методом хроматографии высокого давления,выделением сапонинсодержащей фракции и ее лиофильным высушиванием. Полученный растительный препарат способен эффективно подавлять размножение различных штаммов вируса гриппа. Препарат представляет собой аморфный порошок буровато-коричневого цвета с вкраплениями более темных частиц, со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен, при хранении комкуется. Растворим в воде очищенной,50 растворе ацетона, 30 растворе кислоты уксусной и 10 растворе натрия гидроксида, мало растворим в эфире диэтиловом, практически нерастворим в бензоле, хлороформе и спирте этиловом 95 . Подлинность препарата подтверждается с помощью 5 качественных реакций а) обработка раствором метилового красного в этаноле позволяет обнаружить в растительном экстракте наличие органических кислот (красное окрашивание) б) обработка 3,5 динитросалицилатом с последующим нагреванием при 105 С позволяет определить наличие восстанавливающих Сахаров (черное окрашивание) и невосстанавливающих Сахаров (серо-зеленое окрашивание) в) обработка 0,5-ным раствором йода в хлороформе позволяет обнаружить липиды(коричневое окрашивание) г) обработка раствором аммиака позволяет обнаружить флавоноиды (желтокоричневое окрашивание) д) обработка 2-ным раствором С 3 в метаноле позволяет определить сапонины (пурпурное окрашивание). Сущность изобретения поясняется на следующих примерах. Пример 1 Для получения антивирусного средства используют растение. Корни растения измельчают до получения частиц размером 2-4 мм. Измельченное сырье обрабатывают 2-3 раза 5-кратным объемом хлороформа при комнатной температуре в течение 1,5 часов. После удаления хлороформа растительную массу экстрагируют 3 кратным объемом 75-85 этанола в течение 18 часов при комнатной температуре. Полученный экстракт лиофильно высушивают и используют для фракционирования. Антивирусное средство получают путем фракционирования экстракта методом хроматографии высокого давления. Разделение проводят в градиенте ацетонитрила 080 в присутствии 0,1 трифлуороуксусной кислоты (ТФА) на колонкеС 18, 5, 9,4250 мм. На колонку наносят 500 мг экстракта,разведенного в 1 мл дистиллированной воды. Контроль за хроматографическим процессом осуществляют спектрофотометрическим методом при длинах волн 208 нм и 353 нм. Отбирают фракцию с наибольшим поглощением оптической плотности при 208 нм (зона поглощения сапонинов) и наименьшим поглощением при 353 нм (зона поглощения флавоноидов). Полученную сапонинсодержащую фракцию лиофильно высушивают. Контроль содержания препарата проводят с помощью цветной реакции на сапонины и путем хроматографического анализа. При хроматографическом анализе в препарате выявляется основной пик при длине волны 208 нм,соответствующий сапонинам (Фиг. 1). Содержание сапонинов в конечном препарате должно составлять не менее 70 от сухой массы. Пример 2 Для изучения токсичности антивирусного средства, полученного из растения, проводят испытания на двух видах животных белых мышах обоего пола, массой 18-20 г, и крысах обоего пола, массой 250-350 г. В исследованиях используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания,содержащихся в соответствии с действующими правилами. Перед началом испытаний у животных определяют исходную массу. Испытание на белых мышах. Препарат вводят внутрибрюшинно 5-ти животным в дозе, равной 100 мг на кг веса. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем в объеме не более 0,5 мл. Испытание на крысах. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, 100 мг на кг веса. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем в объеме не более 0,5 мл. Препараты вводят стерильным шприцем,погрешность измерения которого не должна превышать 4. Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 сут. Препарат считают выдержавшим испытание,если- в течение периода наблюдения все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной- ни у одной крысы, получившей препарат подкожно, не развился некроз или абсцесс в месте введения. Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям. Экспериментально установлено, что в дозе до 100 мг на кг веса антивирусное средство,полученное из растенияне обладает острым токсическим действием (табл. 1). Пример 3 Изучение вирусингибирующей активности антивирусного средства, полученного из растения, проводят на модели вируса гриппа А,штамм///30 Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы исследуемого антивирусного средства в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность испытуемого препарата сравнивают с антивирусной активностью коммерческих противовирусных препаратов тамифлю и амизон. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. Экспериментально установлено (табл. 2), что в интервале доз 0,5-5 мг на кг веса антивирусное средство, полученное из растения, полностью подавляет репродукцию исследуемого вируса. На модели штамма вируса гриппа///30 экспериментально установлено, что антивирусное средство, полученное из растенияв дозе 0,5, 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческого препарата амизон, и сопоставим с вирусингибирующей активностью коммерческого препарата тамифлю. Таким образом антивирусное средство,полученное из растения,проявляет выраженный вирусингибирующий 3 эффект в дозе превышающей 5 мг на кг веса на модели штамма вируса гриппа ///30. Пример 4. Изучение вирусингибирующей активности антивирусного средства, полученного из растения, проводят на модели вируса гриппа А, штамм А/малая поганка /Алаколь/791/04. Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы антивирусного средства в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность испытуемого препарата сравнивают с антивирусной активностью коммерческих противовирусных препаратов тамифлю и амизон. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. Показано (табл. 3), что в дозе 0,5 мг на кг веса антивирусное средство, полученное из растения, подавляет репродукцию вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04 на 60. Увеличение дозы препарата до 5 мг на кг приводит к увеличению подавления репродукции штамма А/малая поганка/Алаколь/791/04 до 80. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг на кг приводит к полному подавлению репродукции исследуемого вируса. На модели штамма вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04 экспериментально установлено,что антивирусное средство,полученное из растения, в дозе 0,5, 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческих препаратов амизон и тамифлю. Таким образом антивирусное средство,полученное из растения,проявляет выраженный вирусингибирующий эффект на модели штамма вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04. Пример 5. Изучение вирусингибирующей активности антивирусного средства, полученного из растения, проводят на модели вируса гриппа А, штамм А/крачка/Южная Африка/1/61. Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы антивирусного средства в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность испытуемого препарата сравнивают с антивирусной активностью коммерческих противовирусных препаратов тамифлю и амизон. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. В экспериментах проводится изучение влияния антивирусного средства в различных дозах на вирус гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61 и изучение влияния исследуемого препарата в различных дозах на вирус гриппа в сравнении с коммерческими препаратами тамифлю и амизон. Показано (табл. 4), что в дозе 0,5 мг на кг веса антивирусное средство, полученное из растения, подавляет репродукцию вируса гриппа А А/крачка/Южная Африка/1/61 на 80. Увеличение дозы препарата до 5 и 50 мг на кг приводит к полному подавлению репродукции вируса А/крачка/Южная Африка/1/61. На модели штамма вируса гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61 экспериментально установлено, что вирусингибирующая активность антивирусного средства, полученного из растения, в дозе 0,5, 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческих препаратов амикзон и тамифлю. Таким образом антивирусное средство,полученное из растения,проявляет выраженный вирусингибирующий эффект на модели штамма вируса гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61. Преимущество предлагаемого изобретения заключается в большей эффективности действия полученного растительного антивирусного средства по сравнению с коммерческими антивирусными препаратами амизон и тамифлю против различных штаммов вируса гриппа, низкой токсичности,отсутствии резистентности у вирусов гриппа к новому антивирусному средству, доступности сырья для получения препарата. Предлагаемое антивирусное средство позволяет расширить арсенал противогриппозных препаратов. Таблица 1 Изучение токсичности антивирусного средства, полученного изисследование Токсичность на крысах (подкожное введение) 50 100 Продолжение таблицы Гибель животных 0/5 0/5 0/2 0/2 Некроз или абсцесс 0/5 0/5 0/2 0/2 Контроль - стерильный 0/5 0/2 фосфатный буфер (рН 7,2) ПримечаниеВ числителе дано количество погибших животных или имеющих некроз, в знаменателе - количество животных, получивших препарат. Летальность учитывалась в течение 7 суток после введения препаратов.Доза препарата в мг/ кг животное Таблица 2 Подавление репродукции вируса гриппа штамм///30 под действием антивирусного средства,полученного из растенияколичество препарата Подавление репродукции вирусаамизон антивирусное средство из 0,0 0,0 100,00,0 0,0 0,0 100,00,0 60,05,8 100,00,0 Таблица 3 Подавление репродукции вируса гриппа штамм А/малая поганка/Алаколь/791/04 под действием антивирусного средства, полученного из растенияколичество препарата Подавление репродукции вирусаамизон антивирусное средство из 0,0 0,0 60,05,8 0,0 0,0 80,05,8 20 1,2 100,0 0,0 Таблица 4 Подавление репродукции вируса гриппа штамм А/крачка/Южная Африка/1/61 под действием антивирусного средства, полученного из растенияколичество препарата Подавление репродукции вирусаамизон антивирусное средство из 0,00,0 80,05,8 0,0 0,0 100,00,0 201,2 100,00,0 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Антивирусное средство растительного происхождения, обладающее вирусингибирующей активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа, отличающееся тем, что в качестве антивирусного средства используется лиофильно высушенный малотоксичный сапонинсодержащий препарат, полученный из растения(мыльнянка обыкновенная) путем спиртовой экстракции с последующим фракционированием хроматографией высокого давленияи лиофильным высушиванием,при содержании сапонинов в конечном продукте не менее 70 от сухой массы препарата.