Антивирусное средство растительного происхождения

(51) 61 31/16 (2010.01) 61 39/12 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН в качестве малотоксичного антивирусного средства растительного происхождения,эффективного ингибирующего размножение различных штаммов вируса гриппа. Сущность изобретения в качестве антивирусного средства растительного происхождения, обладающего вирусингибирующей активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа используют лиофильно высушенный водно-спиртовой экстракт растения, содержащий дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типов в соотношении 11 в количестве не менее 13 от сухой массы экстракта. Положительный эффект преимущества предлагаемого антивирусного средства перед существующими заключаются в эффективности действия против различных штаммов вируса гриппа,низкой токсичности, отсутствии резистентности у вирусов гриппа к новому антивирусному средству,доступности сырья для получения препарата. Предлагаемое антивирусное средство выделено из растения флоры Казахстана, позволяет расширить арсенал противогриппозных препаратов и может быть использовано в качестве импортозамещающего противовирусного препарата.(72) Богоявленский Андрей Павлинович Березин Владимир Элеазарович Корулькин Дмитрий Юрьевич Абилов Жарылкасын Абдуахитович Худякова Светлана Сергеевна Турмагамбетова Айжан Сабиржановна Зайцева Ирина Алексеевна Омиртаева Эльмира Серикказыновна Коротецкий Илья Сергеевич Алексюк Павел Геннадьевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) АНТИВИРУСНОЕ СРЕДСТВО РАСТИТЕТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ(57) Использование медицина, в частности,вирусология,а именно разработка новых противовирусных препаратов Цель применение в медицинской и ветеринарной практике препарата, полученного из 23402 Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, а именно разработке новых противовирусных препаратов. Грипп и другие ОРЗ остаются самыми распространенными инфекциями из-за уникальной изменчивости возбудителей и глобального характера эпидемий гриппа. По данным ВОЗ заболевания,обусловленные вирусом гриппа, занимают первое место (35,8) среди причин смертности от вирусных инфекций. В качестве лечебных средств против вируса гриппа используются синтетические химиопрепараты и вещества растительного происхождения. Наиболее известным синтетическим лекарственным средством против вируса гриппа является гидрохлорид -метил 1-адамантилметиламина (ремантадин). Препарат обладает противовирусной активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа А.(Лекарственные средства,применяемые в медицинской практике в СССР/ под ред. М.А.Клюева.-М Медицина.- 1991.- с. 512). Однако,длительное использование ремантадина в медицинской практике, привело к появлению большого количества устойчивых к нему штаммов вируса гриппа, вследствие чего применение данного препарата стало малоэффективным. Известны нафтохиноны из растений рода, проявляющие антивирусные свойства по отношению к различным вирусам, в том числе гриппа и иммунодефицита человека ( ., .,К.,.,., .,.,.,//, 1999,5,869,522). Однако, данные препараты являются токсичными,обладают относительно низкой активностью в отношении вируса гриппа и малодоступны для использования в нашей стране. Известно антивирусное средство растительного происхождения биологически активный полисахарид, выделенный из растения. Данный препарат получают с помощью водной экстракции, хроматографии и ультрафильтрации. Высушенный продукт состоит из разных моносахаров рамнозы, арабинозы, ксилозы,маннозы, глюкозы, галактозы и уроновых кислот. Полисахарид обладает антивирусной активностью в отношении вируса гриппа ( О.,., .,.,. -,//, 1998,5,711,948). Вместе с тем, эффективность данного препарата является относительно невысокой,вирусингибирующее действие проявляется не ко всем исследованным штаммам вируса гриппа. Последний препарат растительного происхождения является наиболее близким аналогом по отношению к заявляемому антивирусному средству. Таким образом, известные антивирусные средства обладают рядом недостатков - они являются недостаточно эффективными, малодоступными или токсичными, что снижает возможность их применения в медицинской практике. Вследствие 2 этого, имеется необходимость разработки новых более активных, малотоксичных препаратов, к которым не имеется устойчивости со стороны штаммов вируса гриппа. Целью изобретения является создание нового малотоксичного антивирусного средства растительного происхождения, эффективного в отношении различных штаммов вируса гриппа. Данная цель достигается путем получения растительного препарата в виде лиофильно высушенного водно-спиртового экстракта из травы растения. Сущность изобретения заключается в получении из травы растенияводноспиртового экстракта, содержащего дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типов, с последующим лиофильным высушиванием экстракта. Полученный растительный препарат способен эффективно подавлять размножение различных штаммов вируса гриппа. Препарат представляет собой аморфный порошок буровато-коричневого цвета с вкраплениями более темных частиц, со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен, при хранении комкуется. Растворим в воде очищенной, 50 растворе ацетона, 30 растворе кислоты уксусной и 10 растворе натрия гидроксида, мало растворим в эфире диэтиловом,практически нерастворим в бензоле, хлороформе и спирте этиловом 95 . Подлинность препарата подтверждается с помощью трех реакций а) от действия раствора аммиака и 10 раствора натрия фосфорномолибденовокислого в кислоте хлороводородной 10,появляется синее окрашивание (арбутин) б) от действия раствора аммиака окраска исходного раствора углубляется до желто-коричневой (флавоноиды) в) от действия 1 раствора квасцов железо-аммониевых, появляется черно-синее окрашивание(гидролизуемые дубильные вещества). Сущность изобретения поясняется на следующих примерах. Пример 1 Для получения препарата из растениярастительное сырье - траву очитка камчатского, размалывают на дробилке до размеров частиц 3-5 мм. Содержание пыли не должно превышать 20. Измельченное сырье подвергают водно-спиртовой экстракции путем обработки 50 водным этанолом при температуре кипения растворителя. Полученный экстракт упаривают на ротационном пленочном испарителе при температуре 60-70 С и остаточном давлении 0,2-0,4 кгс/см 2. Упаренный экстракт высушивают в вакуумвыпарном аппарате при постоянном перемешивании при температуре 50-60 С и разряжении 0,6-0,7 кгс/см 2. Препарат представляет собой смесь дубильных веществ гидролизуемого и конденсированного типов в соотношении 11. Пример 2 Для качественного и количественного контроля подлинности и стандартизации препарата 23402 используют стандартные методы по определению содержания основных компонентов дубильных веществ гидролизуемого и конденсированного типа. 1,0 г (точная навеска) препарата, помещают в колбу вместимостью 100 мл и экстрагируют 50 мл спирта этилового 50, при интенсивном встряхивании в течение 15 минут. Экстракт фильтруют через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 50 до метки и перемешивают. 5 мл полученного раствора помещают в пробирку для центрифугирования, прибавляют 5 мл реактива осаждения. Через 30 мин смесь центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку в пробирке прибавляют 10 мл 0,025 раствора аммиака, содержимое перемешивают стеклянной палочкой, которую промывают 5 мл 0,025 раствора аммиака, прибавляя его к основному объему, и центрифугируют в тех же условиях. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, осадок в пробирке растворяют в 3 мл 30 раствора кислоты уксусной, количественно переносят в колбу вместимостью 250 мл с помощью 80-100 мл воды очищенной, нейтрализуют 25 мл 5 раствора натрия гидрокарбоната, прибавляют 0,5 мл индикатора ксиленолового оранжевого и титруют 0,01 М раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до желтого окрашивания. Содержание дубильных веществв препарате,в пересчете на танин, в процентах, вычисляют по формуле где 0,0013 - количество танина, соответствующее 1 мл 0,01 М раствора динатриевой соли ЭДТА, в граммах К - поправочный коэффициент к молярности 0,01 М раствора динатриевой соли ЭДТА- объем раствора динатриевой соли ЭДТА,израсходованного на титрование, в миллилитрах- масса навески препарата, в граммах. Содержание дубильных веществ в препарате должно быть не менее 13. Пример 3 Для изучения токсичности исследуемого препаратаиспытание проводят на двух видах животных белых мышах обоего пола,массой 18-20 г, и крысах обоего пола, массой 250-350 г. В исследованиях должны быть использованы здоровые животные, содержащиеся в соответствии с действующими правилами, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Массу животных определяют в день начала испытания. Испытание на белых мышах. Препарат вводят внутрибрюшинно 5-ти животным в дозе, равной 100 мг на кг веса. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем в объеме не более 0,5 мл. Испытание на крысах. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, 100 мг на кг веса. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем в объеме не более 0,5 мл. Препараты вводят стерильным шприцем,погрешность измерения которого не должна превышать 4. Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 сут. Препарат считают выдержавшим испытание,если- в течение периода наблюдения все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной- ни у одной крысы, получившей препарат подкожно, не развился некроз или абсцесс в месте введения. Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям. Экспериментально установлено, что в дозе до 100 мг на кг веса препарат изне обладает острыми токсическими свойствами Пример 4 Изучение вирусингибирующей активности препарата изпроводят на модели вируса гриппа А, штамм ///30. Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы исследуемого препарата в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность сравнивают с коммерческими препаратами тамифлю и амиксин. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. Экспериментально установлено (табл. 1). что в дозе 0,5 мг на кг веса экстрактне влияет на репродукцию вируса ///30. Увеличение дозы препарата до 5 мг на кг приводит к подавлению репродукции штамма ///30 до 80. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг на кг приводит к полному (100) подавлению репродукции исследуемого вируса. На модели штамма вируса гриппа ///30 экспериментально установлено, что экстрактв дозе 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческого препарата амиксин,и сопоставим с 3 23402 вирусингибирующей активностью коммерческого препарата тамифлю. Таким образом экстрактпроявляет выраженный вирусингибирующий эффект в дозе превышающей 5 мг на кг веса на модели штамма вируса гриппа ///30. Пример 5. Изучение вирусингибирующей активности препарата изпроводят на модели вируса гриппа А,штамм А/малая поганка/Алаколь/791/04. Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы исследуемого препарата в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность сравнивают с коммерческими препаратами тамифлю и амиксин. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. Экспериментально установлено (табл. 2), что в дозе 0,5 мг на кг веса экстрактподавляет репродукцию вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04 на 20. Увеличение дозы препарата до 5 мг на кг приводит к увеличению подавления репродукции штамма А/малая поганка/Алаколь/791/04 до 60. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг на кг приводит к полному подавлению репродукции исследуемого вируса. На модели штамма вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04 экспериментально установлено, что экстрактв дозе 0,5, 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческих препаратов амиксин и тамифлю. Таким образом экстрактпроявляет выраженный вирусингибирующий эффект на модели штамма вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791 /04. Пример 6. Изучение вирусингибирующей активности препарата изпроводят на модели вируса гриппа А, штамм А/крачка/Южная Африка/1/61. Вирус выращивают в аллантоисной полости 9-10 дневных куриных эмбрионов в течение 24-36 часов при 37 градусах Цельсия. Гемагглютинирующую активность вирусов определяют по стандартной методике с использованием 1-ной взвеси куриных эритроцитов. Ингибирование репродукции вируса определяют при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы исследуемого препарата в разных дозах и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации. Антивирусную активность сравнивают с коммерческими препаратами тамифлю и амиксин. Статистическую обработку материала осуществляют с помощью критерия Стьюдента. В экспериментах проводится изучение влияния исследуемого препарата в различных дозах на вирус гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61 и изучение влияния исследуемого препарата в различных дозах на вирус гриппа в сравнении с коммерческими препаратами тамифлю и амиксин. Экспериментально установлено (табл. 3), что в дозе 0,5 мг на кг веса экстрактподавляет репродукцию вируса гриппа А А/крачка/Южная Африка/1/61 на 60. Увеличение дозы препарата до 5 и 50 мг на кг приводит к полному подавлению репродукции вируса А/крачка/Южная Африка/1/61. На модели штамма вируса гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61 экспериментально установлено, что вирусингибирующая активность экстрактав дозе 0,5, 5 и 50 мг на кг веса превышает вирусингибирующую активность коммерческих препаратов амиксин и тамифлю. Таким образом экстрактпроявляет выраженный вирусингибирующий эффект на модели штамма вируса гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61. Преимущество предлагаемого изобретения заключается в эффективности действия против различных штаммов вируса гриппа, низкой токсичности, отсутствии резистентности у вирусов гриппа к новому антивирусному средству,доступности сырья для получения препарата. Предлагаемое антивирусное средство позволяет расширить арсенал противогриппозных препаратов. Таблица 1 Влияние антивирусного средства из растенияна репродукцию вируса гриппа///30 в сравнении с коммерческими препаратами количество препарата (мг на кг веса) 0,5 5 50 Эффективность ингибирования репродукции вирусатамифлю амиксин антивирусное средство из 20 1,2 0,0 0,0 0,0 0,0 100,00,0 0,0 0,0 80,05,8 100,0 0,0 60,05,8 100,00,0 23402 Таблица 2 Влияние антивирусного средства из растенияна репродукцию вируса гриппа А/малая поганка/Алаколь/791/04 в сравнении с коммерческими препаратами количество препарата (мг на кг веса) 0,5 5 50 Эффективность ингибирования репродукции вирусатамифлю амиксин антивирусное средство из 20 1,2 0,0 0,0 20 1,2 40,02,4 0,0 0,0 60,05,8 80,05,8 20 1,2 100,00,0 Таблица 3 Влияние антивирусного средства из растенияна репродукцию вируса гриппа А/крачка/Южная Африка/1/61 в сравнении с коммерческими препаратами количество препарата (мг на кг веса) 0,5 5 50 Эффективность ингибирования репродукции вирусатамифлю амиксин антивирусное средство из 20 1,2 0,0 0,0 60,05,8 40,02,4 0,0 0,0 100,00,0 80,05,8 20 1,2 100,00,0 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Антивирусное средство растительного происхождения, обладающее вирусингибирующей активностью в отношении различных штаммов вируса гриппа А, отличающееся тем, что используют лиофильно высушенный водноспиртовой экстракт растения,содержащий дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типов в соотношении 11 в количестве не менее 13 от сухой массы экстракта