Штамм гриба Microsporum canis F-MC-13, используемый для получения специфических антигенов и антител при разработке методов диагностики микроспории плотоядных

(51) 12 1/14 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ бульоне Сабуро с добавлением тиамина- и гентамицина в течение 15 суток, что приводит к накоплению биомассы до 12,00,4 г со 100 мл питательной среды,выходу антигена по Л. Табатабай - 10 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл, выходу антигена по методу замораживанияоттаивания - 14 мл 2,0 мг/мл белка с каждых 10 г сухой биомассы гриба, сопровождающееся высокой активностью антигенов в ИФА. Штамм 13,регистрационный номер М-58-13/, получают переклонированием из колоний клинического штамма,длительным пассированием при различных режимах выращивания дерматомицета и адаптацией к условиям глубинного культивирования и используют для получения специфических антигенов, для иммунизации животных, для разработки серологических методов диагностики микроспории плотоядных. Изучение свойств штамма-13 проводят с использованием микроскопии,тестов на перфорацию волос и теста на ферментативную активность с использованием стандартных сред Гиса и среды Кристенсена,реакций РП по Оухтерлони, РА и ИФА. Штамм 13 дает прирост грибной массы до 12,00,4 г со 100 мл питательной среды при глубинном культивировании в течение 14-15 суток, с выходом антигенов - 10,0-14,0 мл с концентрацией белка 0,25-2,0 мг/мл с каждых 10,0 г сухой биомассы гриба образованием при иммунизации животных агглютинирующих антител в титрах 1256, преципитирующих антител в титрах 116 и специфических антител, выявляемые в ИФА,в титрах 112800 активностью в иммуноферментном анализе до 112800, что обеспечивает высокую диагностическую ценность ИФА по сравнению в общепринятыми способами диагностики.(72) Кухар Елена Владимировна Панченко Надежда Александровна Шарипова Айнур Муратовна Никулина Анастасия Игоревна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина 13,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ МИКРОСПОРИИ ПЛОТОЯДНЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой высокоиммуногенный штамм гриба 13, используемый для получения специфических антигенов, для иммунизации животных, разработки серологических методов диагностики микроспории. Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для диагностики микроспории, вызванной М. ,у животных и человека,в санитарной микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды, а также в микологии для изучения таксономии микроорганизмов. Технической задачей изобретения является выделение штамма грибас высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики микроспории плотоядных, которая достигается за счет глубинного культивирования на Сущность изобретения получен новый штамм, обладающий высоким уровнем накопления белков с высокой антигенной активностью и специфичностью, однородностью состава популяции, высокой иммуногенностью,обеспечивающим наработку специфических антител у иммунизированных животных,выявление специфических иммуноглобулинов в высоких титрах при постановке диагностических реакций. Штамм 13 депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Н МОН РК,регистрационный номер -58-13/. При постановке серологических реакций (РА, РИД, ИФА) антигены,выделенные из биомассы предлагаемого штамма 13 НИИПББ М-58-13/,обладают высокой специфической активностью и иммуногенностью, дают более стабильные и достоверные результаты. Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой высокоиммуногенный штамм гриба 13, используемый для получения специфических антигенов, для иммунизации животных, разработки серологических методов диагностики микроспории. Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для диагностики микроспории у животных и человека, вызванной М. , в санитарной микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды, а также в микологии для изучения таксономии микроорганизмов. Известен штамм М-98 гриба,используемый для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики трихофитии верблюдов Пред. патент 10297 РК. П 7 12 1/14 А 61 К 39/00. Штамм М-98 гриба, используемый для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики трихофитии верблюдов / Демченко А.Г., Мадыбаев С.С. заявитель и патентообладатель Научноисследовательский сельскохозяйственный институт.-990661.1 заявл. 09.06.1999 опубл. 15.06.2001,Бюлл. 6. с.2. Штамм М-98 выращивается в жидких картофельно-углеводной или томатноуглеводной средах с 7,2-7,4 при температуре 2830 С в течение 7-9 суток, при этом грибница представлена в виде овальных шариков диаметром 0,3-0,5 см. Для приготовления специфических антигенов используется культуральная жидкость,которую отфильтровывают от мицелиальной биомассы, центрифугируют и лиофилизируют. Недостатком указанного штамма является то, что он используется для постановки реакции диффузионной преципитации и реакции торможения гемагглютинации(Г) с сыворотками крови верблюдов, для получения специфических сывороток от верблюдов и кроликов и не может быть использован для диагностики микроспории у животных и человека, вызванной. Известен штамм грибас высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики руброфитии человека Пат. 24162 РК. МПК 7 12 1/14 А 61 К 39/00. Штамм Т. -8 гриба, используемый для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики руброфитии / Акимбаева А.К.,Муканов К.К., Кухар Е.В. заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - 2009/0942.1 заявл. 22.07.2009 опубл. 15.06.2011, Бюл. 6. с.5. Штамм выращивают в условиях глубинного культивирования 15 суток при 28 С, для получения антигенов используют очищенную биомассу гриба. Недостатком указанного штамма является то, что он предназначен для диагностики руброфитии человека, вызванной антропофильным грибом Т. , и не может быть использован в диагностике микроспории у животных и человека,вызванной. Известен штамм гриба 2084,используемый для контроля иммуногенности вакцин против микроспории животных. Данный штамм обладает характерными, присущими ему культурально-морфологическими,спорообразующими признаками, вирулентными свойствами А.с. СССР 1336559. П 7 51/3 С 12 1/14, А 61 К 39/00, 1986. Недостатком данного штамма является снижение его вирулентных свойств, вследствие преобладания в его популяции слабовирулентных вариантов,неоднородности состава популяции по морфологическим признакам и признаку спорообразования. Это приводит к необъективной оценке иммуногенных свойств вакцин против дерматофитозов животных и получению некачественных антигенных препаратов. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является штаммс. 20, который отличается высоким уровнем спорогенеза и вирулентностью Пат. 2074252 РФ. МПК 7 12 1/14, А 61 К 39/00, 12 1/14, 12 1645. Штамм гриба, используемый для контроля иммуногенности вакцин против дерматофитозов животных. Летягин К.П.,Саркисов К.А., Панин А.Н., Маноян М.Г. Заявитель и патентообладатель Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. - 94029852/13 заявл. 11.08.1994 опубл. 27.02.1997.//./20/70-74/2074252 Данный штамм используют для контроля иммуногенности вакцин против дерматофитозов животных, в состав которых входят штаммы М. . Недостатком указанного штамма является то, что он не адаптирован к глубинному культивированию для получения биомассы штамм, не используется для диагностики микроспории дерматомикоза,вызванного. Технической задачей изобретения является выделение штамма грибас высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики микроспории плотоядных. Штамм получают следующим образом. Клинический штамм дерматомицетавыделен из патологического материала (пораженные волосы) больной кошки с диагнозом микроспория плотоядных,подтвержденным культуральной диагностикой. Для выделения штамма использовали питательный агар Сабуро, содержащий 4 глюкозы. Патологический материал (обломанные волосы, отобранные на границе очага поражения со здоровой кожей) перед посевом выдерживали в 70-ном растворе спирта в течение 20 минут. Кусочки волос раскладывали на расстоянии 1,5-2,0 см друг от друга по периметру чашки Петри. Первичное выделение проводили в условиях 28 С, наблюдение вели в течение 30 суток, колония сформировалась на 25-е сутки. Штамм 13 переклонирован из первичных колоний клинического штамма. В результате длительного пассирования при различных режимах выращивания дерматомицета(температура, , питательные среды, стимуляторы роста,условия культивирования) получен высокоиммуногенный штамм гриба,адаптированный к условиям глубинного культивирования. Продуктивный штамм гриба обозначают 13. Штамм 13, полученный от больной микроспорией кошки в 2012 г. путем ступенчатого отбора колоний, стабильных по культурально-морфологическими признакам,депонирован в 24.12.2013 г. под регистрационным номером -58-13/, хранится в Коллекции микроорганизмов РГП на П Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН Республики Казахстан. Штамм 13 характеризуется следующими признаками и свойствами Морфологические свойства Штамм 13 обладает морфологическими признаками,характерными для возбудителя микроспории плотоядных. В поле зрения микроскопа морфологические элементы штамма 13 представлены в виде бесцветного,септированного,ровного либо разветвленного мицелия (2-3 мкм в диаметре), с наличием ракетовидных клеток. На гифах содержится большое количество макроконидий и хламидоспор. Макроконидии многокамерные,сужены к обоим концам, веретеновидной формы,размером 15-2550-100 мкм. Микроконидии редкие, овальные, грушевидные, отдельно располагающиеся на поверхности мицелия, размером 1,540 мкм. В агаровых блоках отчетливо просматриваются ветвящийся септированный мицелий, в стареющих культурах наблюдаются макроконидии и хламидоспоры размером 3-9 мкм в диаметре. Грамположительные микроорганизмы. Культуральные свойства На агаре Сабуро(глюкоза - 4, пептон - 2, агар - 1,- 0,9), 6,5, при температуре 28 С, в условиях термостата формируются характерные округлые непрозрачные колонии диаметром 60-70 мм (25 дней роста), плотной консистенции, пушистые, с возрастом мучнистые с паутинистым растущим краем. Зрелые колонии мучнистые с очагами роста белого пушистого мицелия, серовато-белые в течение всего срока культивирования, отличаются наличием слабо выраженных конических колец и хорошо заметных радиальных борозд. Обратная сторона колоний в начале роста имеет бежеворозоватый цвет, затем - выраженный желтооранжевый пигмент с интенсивным желтым ободком. При пересевах колонии бархатистопушистые, белые. На кукурузном агаре (глюкоза - 4,0 г,1,0 г, кукурузная мука - 4,0 г, агар 1,8 г на 100 мл дистиллированной воды) формируются характерные белые пушистые колонии с паутинистыми краями диаметром до 70 мм. Колония с обратной стороны в центре имеет оранжевый оттенок диаметром до 0,5 см, остальная поверхность желтая. Колонии плотные,крупно-складчатые,в центре морщинистые, с радиальными прерывающимися полосами. Обратная сторона колоний желтооранжевого цвета. На картофельном агаре (экстракт картофеля 20,0 г, глюкоза - 2,0 г, агар - 1,5 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде плоской колонии, сильно складчатой, мучнистой в центре и пушистой стелющейся по периферии, в центре колония кремового оттенка серовато-белого цвета,по периферии кремового, растущий край ровный,обратная сторона колонии бледно-желтая, диаметр колонии 62-67 мм (25 дней роста). На медовом агаре (мед - 8,0 г, пептон - 2,0 г,агар - 1,8 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде мощной колонии приподнятой по всему периметру роста, ближе к растущему краю плоской, пушистой, с паутинистым растущим краем,белого цвета, диаметр колонии 66-73 мм (25 дней роста). На агаре Чапека (сахар - 3,0 г, агар - 1,5 г, нитрат натрия 0,2 г, дифосфат калия - 0,1, сульфт магнезии - 0,05 г, хлорид калия - 0,05 г, сульфат железа - 0,001 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде прозрачной, паутинистой колонии,мицелий в основном субстратный, в центре белый плотный бархатистый мицелий, обратная сторона колонии светло желтая, диаметр колонии 34-57 мм(25 дней роста). Тест на перфорацию волос Для проведения теста на перфорацию волос посевы осуществляли на детские, женские волосы и волосы кошек. При этом 3 установили, что тест на перфорацию волос для штамма 13 отрицательный,т. к. повреждения волос в виде характерного конуса не обнаруживаются. Ферментативная активность в отношении углеводов При изучении ферментативной активности гриба посев проводили на стандартные среды Гисса с сахарозой, глюкозой, лактозой,мальтозой и маннитом (пептон протеозы - 1,0 г, - 0,5 г, сахароза (или глюкоза, лактоза,мальтоза и маннит, соответственно) - 0,5 г, экстракт говядины - 0,1 г, фенол красный - 0,0018 г на 100 мл дистиллированной воды) и среду Кристенсена(агар - 1,5 г,- 0,5 г, дифосфат натрия - 0,12 г,фосфат калия - 0,8 г, пептон - 0,1 г, декстроза - 0,1 г,фенол красный - 0,0012 г на 95 мл дистиллированной воды, после приготовления среды добавляем 5 мл 40-го уреазного раствора). В результате исследований у гриба 13 установлена высокая активность дерматомицета в разложении углеводов сахарозы,глюкозы и маннита, слабая - в отношении мальтозы,лактозы. Отмечено наличие слабо выраженной уреазной активности. Продуктивность штамма При глубинном культивировании на бульоне Сабуро (70 от объема ферментера) с добавлением тиамина-НС (глюкоза 4, пептон - 2, поваренная соль, хч. - 0,96,5,при температуре 28 С, активная аэрация, 100-120 об./мин) на 14-15-й день ферментации формируются отдельные круглые колонии (пелетты или глобулы) диаметром 7,0-8,5 мм. Выход биомассы - до 12,00,4 г со 100 мл питательной среды. Целевым продуктом биосинтеза являются поверхностные растворимые белки дерматомицета,являющиеся первичными метаболитами и накапливающимися в клеточной клетке. Выход специфического растворимого белкового антигена по Л. Табатабай - 10 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл, белкового антигена по методу замораживания-оттаивания - 14 мл 2,0 мг/мл белка с каждых 10 г сухой биомассы гриба. Генетическая характеристика штамма 13 Методом мультилокусного сиквенс-типирования по Сенгеру с использованием пары праймеров 4 и 5 и анализа последовательностей ДНК дерматомицета в международной базе данныхштамм идентифицирован как представитель несовершенных грибов родавидаили 13 Е 181444.1100. Характеристика полезного продукта В серологических тестах у антигенов, выделенных из биомассы культуры штамма выявлено наличие преципитирующих и агглютинирующих свойств,высокая активность в иммуноферментном анализе. В ответ на парентеральное или внутривенное введение культурального или растворимого белкового антигена в организме белых мышей и кроликов образуются агглютинирующие антитела в титрах 1256, преципитирующие антитела в титрах 116 и специфические антитела в титрах 112800,выявляемые в ИФА. 4 Методы оценки специфичности антигена непрямой вариант ИФА, реакции преципитации по Оухтерлони, реакция агглютинации (капельный и микровариант). Контаминация штамма Контаминантов в культуре, включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено. Лиофилизация Лиофильное высушивание культуры гриба проводят в защитной среде с желатином желатин 1,5, сахароза 10, агар-агар 0,1. Режим замораживания суспензию клеток в защитной среде разливают в стерильные стеклянные ампулы или в стеклянные флаконы с резиновыми пробками и металлическими крышечками по 1 см 3,охлаждают до -70 С, устанавливают в лиофильную камеру и высушивают. Ампулы запаивают и хранят в морозильной камере при минус 18 С. Условия размораживания. Флакон с клетками штамма дерматомицета вынимают из морозильной камеры, нагревают до комнатной температуры. После чего, сухую таблетку растворяют стерильным физиологическим раствором до исходного объема. Штамм 13 используют следующим образом. Пример 1. Двухнедельная культура дерматомицета М.13, полученная выращиванием на бульоне Сабуро в глубинных условиях, отделяется от культуральной жидкости низкоскоростным центрифугированием,трехкратным отмыванием от культуральной жидкости в физрастворе с фильтрацией через бумажные фильтры. В дальнейшем из биомассы получают различные антигены. Очистка антигенов проводится методом низкоскоростного центрифугирования и диализа. Концентрация белка в антигенах определяется по Бредфорду. Получение антигена (АГ 1) по методу.. (1979) заключается в обработке 15-суточной биомассы дерматомицетов нитратным буфером и неоднократном центрифугировании супернатанта. Концентрация белка в растворах антигена составляет 0,250 мг/мл. Получение белкового антигена (АГ 2) по методу замораживания и оттаивания включало обработку 15-суточной биомассы жидким азотом и механическим разрушением в 10-ном Н с периодическим замораживанием и оттаиванием и неоднократном центрифугировании супернатанта. Концентрация белка в растворах антигена составляет 2,0 мг/мл. Пример 2. Белым лабораторным мышам в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг антигена М.13 в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда, на седьмой день - 100 мкг антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в 0,1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР),7,2-7,4. На 17 сутки тестируют сыворотки иммунизированных мышей в непрямом варианте твердофазного ИФА. Тестирование иммунных сывороток проводят с использованием соответствующего антигена М.13 и антивидового конъюгата. Титр специфических антител в сыворотках белых мышей составляет от 13200 до 112800. Пример 3. В реакции преципитации в 1 агарозном геле выявлено наличие преципитирующих свойств у белковых антигенов гриба М.13, которое определяется наличием четко выраженной линией преципитации между антигеном и сывороткой крови мышей,иммунизированных соответствующим антигеном, и отсутствием перекрестной реакции к другим дерматомицетам (таблица 1). Таблица 1 Образование линий преципитации с сыворотками иммунных мышей к АГ 1 к АГ 2 Пример 4. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют антигены М.13 по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР,7,2-7,4 при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв), готовят в лунках панели двукратные разведения иммунных сывороток лабораторных мышей, начиная с 1100 и выше в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкубации сывороток планшет отмывают описанным способом и вносят в лунки антивидовой конъюгат (антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой). Через 1 час повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против антигенов М.13 определяют количественно по расщеплению субстрата Н 2 О 2 в присутствии хромогена. Положительная реакция характеризуется желто-коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм (таблица 2). Таблица 2 Результаты изучения активности антигенов М.13 в ИФА Антигены М.13 АГ 1 по .. (1979) АГ 2 по замораживанию-оттаиванию Как видно из таблицы 2, наибольшее разведение антигена, позволяющее выявлять титры антител в сыворотках крови беспородных мышей, равно 112800. При этом показатель оптической плотности(ОП) варьировал в пределах от 1,104 до 1,687 у АГ 1 и в пределах от 1,050 до 1,298 у АГ 2. Таким образом, штамм М.13,регистрационный номер М-58-13/, используется для получения специфических антигенов, для иммунизации животных с целью получения сывороток, для разработки серологических методов диагностики микроспории плотоядных у животных и человека. Штамм гриба 13 дает прирост грибной массы до 12,00,4 г со 100 мл питательной среды при глубинном культивировании в течение 14-15 суток. Выход специфического растворимого белкового антигена по Л. Табатабай 10 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл, антигена по методу замораживания-оттаивания - 14 мл 2,0 мг/мл белка с каждых 10 г сухой биомассы гриба. В ответ на иммунизацию лабораторных животных антигенами М.13 в организме белых мышей образуются агглютинирующие антитела в титрах 1256, преципитирующие Показатель ОП при разведении сыворотки 1100 1,104-1,187 1,052 - 1,298 антитела в титрах 116 и специфические антитела в титрах 112800, выявляемые в ИФА. При постановке ИФА наибольшее разведение антигена,позволяющее выявлять титры антител в сыворотках крови беспородных мышей, равно 112800 с высокими показателями оптической плотности (ОП) антигена (от 1,052 до 1,298), что обеспечит высокую диагностическую ценность иммуноферментного анализа. Использование антигенов, выделенных из культуры гриба штамма М.-МС-13, на предприятиях-изготовителях диагностических препаратов, в диагностических учреждениях,занимающихся диагностикой дерматомикозов животных,в научно-исследовательских лабораториях позволит с большей достоверностью диагностировать микроспорию плотоядных,вызванную,выявлять возбудителя болезни в объектах внешней среды,использовать в микологии для изучения таксономии грибов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гриба 13,депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК под номером М-58-13/,используемый для получения специфических антигенов и антител при разработке методов диагностики микроспории плотоядных.