Штамм гриба Trichophyton interdigitale F-Tm-i-5, используемый для получения специфических антигенов и антител при серологической диагностике микозов, вызванных Trichophyton interdigitale

(51) 61 39/00 (2006.01) 12 1/14 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ которая достигается за счет глубинного культивирования на бульоне Сабуро с добавлением тиамина- и гентамицина в течение 15 суток,выходом биомассы до 3,580,71 г со 100 мл питательной среды, выходом белкового антигена 1,5 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл с каждых 10 г сухой биомассы гриба. Штамм 5,регистрационный номер М-59-13/, получают переклонированием из колоний клинического штамма Т. , длительным пассированием при различных режимах выращивания дерматомицета и адаптацией к условиям глубинного культивирования и используют для получения специфических антигенов, для иммунизации животных, для разработки серологических методов диагностики микозов, вызванных Т. . Изучение свойств штамма 5 проводят с использованием микроскопии, теста на перфорацию волос и теста на ферментативную активность на средах Гисса и Кристенсена, антигенную активность в реакциях РП по Оухтерлони, РА и ИФА. Штамм 5 имеет прирост грибной массы до 3,580,71 г со 100 мл питательной среды при глубинном культивировании в течение 14-15 суток, выход антигена по Л. Табатабай - 3 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл активность в ИФА до 112800. В ответ на иммунизацию лабораторных животных антигенами Т.5 в организме белых мышей образуются агглютинирующие антитела в титрах 1128, преципитирующие антитела в титрах 132 и специфические антитела в титрах 112800,выявляемые в ИФА. При постановке ИФА наибольшее разведение антигена, позволяющее выявлять титры антител в сыворотках крови беспородных мышей, равно 112800 с показателем оптической плотности антигена от 0,830 до 1,022,что обеспечивает высокую ценность ИФА в диагностике микозов, вызванных Т. .(72) Кухар Елена Владимировна Акимбаева Айнур Курманбековна Егорчева Евгения Вячеславовна Шарипова Айнур Муратовна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГРИБА 5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ ПРИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ МИКОЗОВ, ВЫЗВАННЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой высокоиммуногенный штамм гриба Т.5, используемый для получения специфических антигенов,для иммунизации животных, разработки серологических методов диагностики микозов,вызванных Т.. Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для диагностики трихофитии, вызванной Т. ,в санитарной микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды, а также в микологии для изучения таксономии микроорганизмов. Технической задачей изобретения является выделение штамма гриба 5 с высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики трихофитии, вызванной Т. , 30171 Сущность изобретения получен новый штаммсинонимвариант 5,адаптированный к глубинному культивированию,обладающий высоким уровнем накопления белков с высокой антигенной активностью и специфичностью,характеризующийся однородностью состава популяции, высокой иммуногенностью, обеспечивающим наработку специфических антител у иммунизированных животных,выявление специфических иммуноглобулинов в высоких титрах при постановке диагностических реакций. Штамм 5 депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Н Н РК,регистрационный номер -59-13/. При постановке серологических реакций (РА, РИД, ИФА) антигены,выделенные из биомассы предлагаемого штамма 5 НИИПББ -5913/,обладают высокой специфической активностью и иммуногенностью, дают более стабильные и достоверные результаты в ИФА. Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой высокоиммуногенный штамм гриба 5,используемый для получения специфических антигенов, для иммунизации животных, разработки серологических методов диагностики гипсовой трихофитии и онихомикоза. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики микозов человека, вызванных Т. , в санитарной микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды, а также в микологии для изучения таксономии микроорганизмов. Известен штамм М-98 гриба,используемый для получения специфических антигенов и сывороток Пред. патент 10297 РК. МПК 7 12 1/14 А 61 К 39/00. Штамм М-98 гриба,используемый для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики трихофитии верблюдов / Демченко А.Г., Мадыбаев С.С. заявитель и патентообладатель Научноисследовательский сельскохозяйственный институт.- 990661.1 заявл. 09.06.1999 опубл. 15.06.2001,Бюлл. 6. с.2 Штамм М-98 выращивается в жидких картофельно-углеводной или томатноуглеводной средах с 7,2-7,4 при температуре 2830 С в течение 7-9 суток, при этом грибница представлена в виде овальных шариков диаметром 0,3-0,5 см. Для приготовления специфических антигенов используется культуральная жидкость,которую отфильтровывают от мицелиальной биомассы, центрифугируют и лиофилизируют. Недостатком указанного штамма является то, что он предназначен для получения антигена, который используют для постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) с сыворотками крови верблюдов и в реакции торможения гемагглютинации (ГА), а также для получения 2 специфических сывороток от верблюдов и кроликов диагностики трихофитии верблюдов и не может быть использован в диагностике трихофитии,вызванной также полученные антигены не используют для постановки ИФА. Известен штамм грибас высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и диагностических сывороток Пат. 24162 РК. МПК 7 12 1/14 А 61 К 39/00. Штамм Т.- 8 гриба,используемый для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики руброфитии / Акимбаева А.К.,Муканов К.К., Кухар Е.В. заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - 2009/0942.1 заявл. 22.07.2009 опубл. 15.06.2011, Бюл. 6. .5. Дерматомицет варащивается в условиях глубинного культивирования при 28 С в течение 15 суток,биомасса отмывается и используется для получения антигенов. Недостатком указанного штамма является то, что он предназначен для диагностики руброфитии, вызванной Т. , и не может быть использован в диагностике трихофитии, вызванной. Известен штаммВГНКИ 18-ДЕП, обладающий обильным конидиобразованием,однородностью состава популяции,стабильными вирулентными свойствами,обеспечивающий эффективный контроль иммуногенных свойств биопрепаратов против трихофитии животных Пат. 2013444 РФ. МПК 7 С 12 1/14. Штамм гриба,используемый для контроля иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных. Яблочник Л, Панин А.Н.,Жарков И.И., Летягин К.П. Заявитель и патентообладатель Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. - 92015457/13 заявл. 30.12.1992 опубл. 30.05.1994.//./20/10-14/2013444 При оценке иммуногенных свойств штамма 18 от аналогичных отличается более стабильными и достоверными результатами. Недостатками данного штамма являются использование его только для изготовления вакцины против трихофитии животных не используется для диагностики антропофильных дерматомикозов не адаптирован к росту в условиях глубинного культивирования. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является штаммВГНКИ 27-ДЕП,обладающий высоким уровнем спорогенеза, однородностью состава популяции,низкой остаточной вирулентностью и тем самым повышающий иммуногенную активность биопрепарата против трихофитии животных Пат. 2013445 РФ. МПК 7 12 1/14, А 61 К 39/02. Штамм гриба, используемый для изготовления вакцины против трихофитии животных. Яблочник Л,Папин А.Н.,Летягин К.П., Саркисов К.А. Заявитель и патентообладатель Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. - 92015463/13 заявл. 30.12.1992 опубл. 30.05.1994.//./20/10-14/2013445 Данный штамм используют для приготовления вакцин против трихофитии животных. Вакцина, изготовленная из штамма Т.27 обеспечивает крупному рогатому скоту, овцам, козам и кроликам образование стойкого напряженного иммунитета спустя 20-30 дней после применения. Введение культуры штамма в организм телят, овец, кроликов стимулирует образование специфических агглютининов в титрах 140-11280. Недостатками указанного штамма является то, что штамм выращивается методом поверхностного культивирования он не адаптирован к глубинному выращиванию для получения биомассы штамм не используется для получения диагностических антигенов штамм не применяется в разработке иммуноферментного анализа для диагностики трихофитии и онихомикозов, вызванных Т.. Технической задачей изобретения является выделение штамма грибас высокой антигенной активностью и специфичностью, адаптированного к глубинному культивированию и обладающего высокой скоростью роста, пригодного для получения специфических антигенов и сывороток для диагностики микозов,обусловленных Т.. Штамм получают следующим образом. Клинический штамм дерматомицетавариант Т.выделен из патологического материала (пораженные ногти) больного человека с диагнозом онихомикоз,обусловленный Т. , подтвержденным культуральной диагностикой. Для выделения штамма использовали питательный агар Сабуро,содержащий 4 глюкозы. Патологический материал(пораженные ногти) перед посевом выдерживали в 70-ном растворе спирта в течение 20 минут. Ногти раскладывали на расстоянии 1,5-2,0 см друг от друга по периметру чашки Петри. Первичное выделение проводили в условиях 28 С, наблюдение вели в течение 30 суток. Штамм-Т 5 переклонирован из колоний клинического штамма. В результате длительного пассирования при различных режимах выращивания дерматомицета (температура, , питательные среды,стимуляторы роста,условия культивирования) получен высокоиммуногенный штамм гриба, адаптированный к условиям глубинного культивирования. Продуктивный штамм гриба обозначают 5. Штамм-Т 5,полученный от больного человека в 2010 году путем ступенчатого отбора колоний, стабильных по культурально-морфологическими признакам,депонирован в 24.12.2013 г. под регистрационным номером -59-13/, хранится в Коллекции микроорганизмов РГП на ПХВ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН Н Республики Казахстан. Штамм 5 характеризуется следующими признаками и свойствами Морфологические свойства Штамм 5 обладает морфологическими признаками,характерными для возбудителя гипсовой трихофитии. В поле зрения микроскопа морфологические элементы штамма 5 представлены в виде тонкого и ровного слабоветвящегося мицелия с многочисленными артроспорами. Отдельные гифы закручены в спирали. Мицелий бесцветный,септированный, распадающийся на артроспоры с редко встречающимися макроконидиями,с наличием овальных микроконидий. Микроконидии обильные,каплевидные,удлиненные или грушевидные, располагающиеся по бокам мицелия. В агаровых блоках отчетливо просматриваются ветвящийся септированный мицелий, в стареющих культурах наблюдаются артроспоры размером 5-10 мкм в диаметре. Грамположительные микроорганизмы. Культуральные свойства На агаре Сабуро (агар 1, глюкоза - 4, пептон - 2, поваренная соль,хч. - 0,9), Н 6,5, при температуре 28 С, в условиях термостата формируются характерные округлые непрозрачные колонии диаметром 60-70 мм (15 дней роста), плотной консистенции. Колонии пушистые и бархатистые плотные, или мучнистые с ровным растущим краем. Зрелые колонии белого цвета со слабо выраженными кольцами и хорошо заметными радиальными бороздами. В центре колонии наблюдается пуговчатое возвышение. Обратная сторона колоний песочного цвета, с выраженной морщинистостью, с разрывами питательной среды. На средах с естественными источниками углеводов (мед, кукуруза, картофель) культура Т.растет достаточно быстро,формирование зрелых колоний завершается на 13-15 сутки с диаметром 7080 мм. На медовом агаре (мед - 8,0 г, пептон - 2,0 г,агар - 1,8 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде сплошной белой пушистой колонии приподнятой по всему периметру роста, с углублением в центе, диаметр колонии 76-80 мм (15 суток роста). На кукурузном агаре (глюкоза - 4,0 г,1,0 г, кукурузная мука - 4,0 г, агар 1,8 г на 100 мл дистиллированной воды) формируются характерные белые густомучнистые колонии диаметром до 60-70 мм с ровными краями и наличием каймы 3 глубинного роста до 10 мм. Колония с обратной стороны в центре имеет светло-желтый оттенок. Колонии плотные, зональные, в центре пуговчатое возвышение, с радиальными полосами (15 дней роста). На картофельном агаре (экстракт картофеля 20,0 г, глюкоза - 2,0 г, агар - 1,5 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде плоской колонии, мучнистой в центре и бархатистой по периферии, белого цвета, растущий край ровный,обратная сторона колонии бледно-желтая, диаметр колонии 45-57 мм (15 дней роста). На агаре Чапека (сахар - 3,0 г, агар - 1,5 г, нитрат натрия 0,2 г, дифосфат калия - 0,1, сульфат магнезии - 0,05 г, хлорид калия - 0,05 г, сульфат железа - 0,001 г на 100 мл дистиллированной воды) растет в виде мелкой пушистой колонии, мицелий в основном субстратный, в центре белый плотный бархатистый мицелий, обратная сторона колонии без пигмента, диаметр колонии 25-40 мм (15 дней роста). Тест на перфорацию волос Для проведения теста на перфорацию волос посевы осуществляли на детские и женские волосы и волосы кошек. При этом установили, что тест на перфорацию волос для штамма 5 положительный,т.к. при микроскопии обнаруживаются повреждения волос в виде характерного конуса. Ферментативная активность в отношении углеводов При изучении ферментативной активности гриба 5 посев проводили на стандартные среды Гисса с сахарозой, глюкозой, лактозой, мальтозой и маннитом (пептон протеозы - 1,0 г,- 0,5 г,сахароза (или глюкоза, лактоза, мальтоза и манит,соответственно) - 0,5 г, экстракт говядины - 0,1 г,фенол красный - 0,0018 г на 100 мл дистиллированной воды) и среду Кристенсена(агар - 1,5 г,- 0,5 г, дифосфат натрия - 0,12 г,фосфат калия - 0,8 г, пептон - 0,1 г, декстроза - 0,1 г,фенол красный - 0,0012 г на 95 мл дистиллированной воды, после приготовления среды добавляем 5 мл 40-го уреазного раствора). При наблюдении за ростом грибов в течение 5 суток на средах Гисса отмечали изменение цвета среды и образования пузырьков газа в пробирках с глюкозой,сахарозой и мальтозой,менее интенсивные процессы - в пробирках с маннитом и лактозой. Данные свидетельствуют о высокой сахаролитической активности штамма. На среде Кристенсена отмечали ярко выраженную уреазную активность, среда из оранжевого цвета становилась ярко розовой, что свидетельствует наличии фермента уреазы. Продуктивность штамма При глубинном культивировании штамма Т.5 на бульоне Сабуро (70 от объема ферментера) с добавлением тиамина- (глюкоза - 4, пептон 2, поваренная соль, хч. - 0,9 Н 6,5, при температуре 28 С,активная аэрация,100-120 об./мин) на 14-15-й день ферментации формируются отдельные круглые колонии (пелетты 4 или глобулы) диаметром 8,0-8,5 мм. Выход биомассы - до 3,580,71 г со 100 мл питательной среды. Целевым продуктом биосинтеза являются поверхностные растворимые белки дерматомицета,являющиеся первичными метаболитами и накапливающимися в клеточной клетке. Выход специфического растворимого белкового антигена 1,5 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл с каждых 10 г сухой биомассы гриба. Характеристика полезного продукта В серологических тестах у антигенов, выделенных из биомассы культуры штамма 5 выявлено наличие преципитирующих и агглютинирующих свойств,высокая активность в иммуноферментном анализе. В ответ на парентеральное или внутривенное введение культурального или растворимого белкового антигена в организме белых мышей и кроликов образуются агглютинирующие антитела в титрах 1128, преципитирующие антитела в титрах 132 и специфические антитела в титрах 112800,выявляемые в ИФА. Генетическая характеристика штамма 5 Методом мультилокусного сиквенс-типирования по Сенгеру с использованием пары праймеров 4 и 5 и анализа последовательностей ДНК дерматомицета в международной базе данныхштамм идентифицирован как представитель несовершенных грибов родавидаили 5 АР 168124 100. Методы оценки специфичности антигена непрямой вариант ИФА, реакции преципитации по Оухтерлони, реакция агглютинации (капельный и микровариант). Контаминация штамма Контаминантов в культуре, включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено. Лиофилизация Лиофильное высушивание культуры гриба проводят в защитной среде с желатином желатин 1,5, сахароза 10, агар-агар 0,1. Режим замораживания суспензию клеток в защитной среде разливают в стерильные стеклянные флаконы с резиновыми пробками и металлическими крышечками по 1 см 3, охлаждают до -70 С,устанавливают в лиофильную камеру и высушивают. Флаконы укупоривают и хранят в морозильной камере при минус 18 С. Условия размораживания. Флакон с клетками штамма дерматомицета вынимают из морозильной камеры, нагревают до комнатной температуры. После чего, сухую таблетку растворяют стерильным физиологическим раствором до исходного объема. Штамм 5 используют следующим образом. Пример 1. Двухнедельная культура дерматомицета Т.5, полученная выращиванием на бульоне Сабуро в глубинных условиях, отделяется от культуральной жидкости низкоскоростным центрифугированием, отмывается трехкратно от культуральной жидкости, 30171 фильтруется через бумажные фильтры. В дальнейшем из биомассы получают растворимые белковые антигены. Очистка антигенов проводится методом низкоскоростного центрифугирования и диализа. Концентрация белка в антигенах определяется по Бредфорду. Получение антигена (АГ 1) по методу.. (1979) заключается в обработке 15-суточной биомассы дерматомицетов цитратным буфером и неоднократном центрифугировании супернатанта. Концентрация белка в растворах антигена составляет 0,250 мг/мл. Пример 2. Белым лабораторным мышам в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг антигена Т.5 в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда, на седьмой день 100 мкг антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Н 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в 0,1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР),рН 7,2-7,4. На 17 сутки тестируют сыворотки иммунизированных мышей в непрямом варианте твердофазного ИФА. Тестирование иммунных сывороток проводят с использованием соответствующего антигена Т.5 и антивидового конъюгата. Титр специфических антител в сыворотках белых мышей составляет от 16400 до 112800. Пример 3. В реакции преципитации в 1 агарозном геле выявлено наличие преципитирующих свойств у белкового антигена гриба Т.5, которое определяется наличием четко выраженной линией преципитации между антигеном и сывороткой крови мышей,иммунизированных белковым антигеном,и отсутствием перекрестной реакции к другим дерматомицетам (таблица 1). Таблица 1 Образование линий преципитации с сыворотками иммунных мышей к Т.5 Пример 4. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют антигены Т. 5 по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР,7,2-7,4 при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв), готовят в лунках панели двукратные разведения иммунных сывороток лабораторных мышей, начиная с 1100 и выше в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкубации сывороток планшет отмывают описанным способом и вносят в лунки антивидовой конъюгат (антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой). Через 1 час повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против антигенов Т.5 определяют количественно по расщеплению субстрата Н 2 О 2 в присутствии хромогена. Положительная реакция характеризуется желто-коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм (таблица 2). Таблица 2 Изучение активности антигенов Т.5 в ИФА Как видно из таблицы 2, наибольшее разведение антигена, позволяющее выявлять титры антител в сыворотках крови беспородных мышей, равно 112800. При этом показатель оптической плотности 5, регистрационный номер -59-13/,используется для получения специфических антигенов, для иммунизации животных с целью получения сывороток,для разработки серологических методов диагностики микозов,вызванных Т. . Штамм гриба Т.5 дает прирост грибной массы до 3,580,71 г со 100 мл питательной среды. Выход специфического Показатель ОП при разведении сыворотки 1100 0,830-1,022 растворимого белкового антигена - 1,5 мл с концентрацией белка 0,25 мг/мл с каждых 10 г сухой биомассы гриба. В ответ на иммунизацию лабораторных животных антигенами Т. 5 в организме белых мышей образуются агглютинирующие антитела в титрах 1128,преципитирующие антитела в титрах 132 и специфические антитела в титрах 112800,выявляемые в ИФА. При постановке ИФА наибольшее разведение антигена, позволяющее выявлять титры антител в сыворотках крови беспородных мышей, равно 112800 с высокими показателями оптической плотности (ОП) антигена диагностическую ценность иммуноферментного анализа. Использование антигенов, выделенных из культуры гриба штамма 5,на предприятиях-изготовителях диагностических препаратов, в диагностических учреждениях,занимающихся диагностикой дерматомикозов животных,в научноисследовательских лабораториях позволит с большей достоверностью диагностировать микозы,вызванные, выявлять возбудителя болезни в объектах внешней среды, использовать в микологии для изучения таксономии грибов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гриба 5,депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК под номером М-59-13/,используемый для получения специфических антигенов и антител при серологической диагностике микозов, вызванных