Способ серологической диагностики микроспории плотоядных

(51) 61 39/40 (2006.01) 01 33/52 (2006.01) 01 33/53 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ достигается тем, что при постановке реакции в качестве антигена для сенсибилизации планшета используют антиген, выделенный из возбудителя микроспории грибаМ-58-13/,а выявление в сыворотке крови кошек и собак,специфичных к названному антигену, антител класса , образование которых характерно для микроспории, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти-. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина ОП которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю ОП отрицательного контроля. Процент выявления больных животных по клиническим признакам составил 30, в РМА 74, в предлагаемом ИФА - 88. Титры антител иммунизированных животных равны 1100-1800, у больных кошек - 1200-16400, у больных собак 1800-13200. Использование предлагаемого варианта ИФА позволит повысить качество диагностики микроспории.(72) Кухар Елена ВладимировнаКиян Владимир СергеевичШарипова Айнур МуратовнаГлотова Татьяна ИвановнаТугунова Татьяна БорисовнаПаламарчук Анна Владимировна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКРОСПОРИИ ПЛОТОЯДНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей способа является разработка ИФА для совершенствования диагностики микроспории плотоядных, которая Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Известен ряд способов диагностики микроспории,основанных на выявлении возбудителя инфекции в патологическом материале или на выявлении специфических антигенов кв сыворотке крови животных. Люминесцентный анализ патологического материала, который проводится с использованием ртутно-кварцевых ламп и других люминесцентных аппаратов,оснащенных фильтром Вуда,используется для дифференциации микроспории от трихофитии Ханис А.Ю. Вирулентные и люминесцентные свойства разных штаммов М.Ветеринария. - М., 2004. - 2. с.25-27. Метод основан на способности волос, пораженных грибами рода , флуоресцировать ярко-зеленым светом при облучении ультрафиолетом с длинной волны 365 нм. Этот феномен связан с продукцией флуоресцирующего пигмента - птеридина. Микроскопию патологического материала Лабораторные исследования в ветеринарии биохимические и микологические справочник/сост. Б.И. Антонов. - М., 1991. с.286 проводят, отбирая волоски с белыми чехликами у корня,предварительно обрабатывая их 10-20 растворомили КОН с подогревом и просматриванием в капле 50 глицерина. Микроскопия проводится с использованием объектива 10, затем 40. С целью точного определения вида выявленного возбудителя проводят выделение чистой культуры возбудителя Горячкина Е.И. Дифференциальная диагностика культур родови, полученных от пушных зверей,домашних животных и человека при посевах на различные питательные среды//Селекция,кормление, содержание животных и технология продуктов животноводства. - 1999. с.124-126. Высев патологического материала производят на среду Сабуро или на сусло-агар с добавлением антибиотиков с целью подавления роста сопутствующей микрофлоры при 6,2-6,8. Посевы выдерживают в аэробных условиях в термостате при температуре 28 С в течение 20-30 суток. Формирование колоний наступает на 10-14 день после начала роста для М. , на 20-25 день для М. . Для диагностики микроспории кошек предложена реакция связывания комплемента (РСК) Левченко Е.Н. Применение РСК при диагностике микроспории у домашних кошек//Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. Спец. выпуск (мат. межд. конф.). - Астана, 2008. с.299-303. Постановка реакции осуществляется с антигеном,не обладающим антикомплементарными свойствами, в разведении 1100. Сыворотка крови кошек на наличие антител к микроспоруму исследуется в разведении 15-110 после инактивации при 60 С в течение 30 минут. С помощью РСК выявляются животные с позитивными показаниями, из которых 46,1 имеют клинические признаки болезни. При клиническом исследовании 5,8 из них имели отрицательные показания, при отрицательной 2 клинике - 7,7 из числа исследованных имели сомнительные показатели РСК. К общим недостаткам приведенных способов диагностики, является их низкая чувствительность(процент выявления возбудителей культуральным методом - 22-61,5, средняя чувствительность микроскопии - 53,8, чувствительность РСК 70,7). К тому же, применение РСК для серологической диагностики микроспории кошек не вышло за рамки лабораторных испытаний. Одним из высокочувствительных и легко выполнимых аналитических тестов, используемых в иммунологии,является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящее время разработаны оптимальные условия и техника постановки твердофазного ИФА для диагностики кандидоза Караев З.О.,Бабенко Г.А., Игнатьева С.М., Соловьева Г.И. Антигенные препараты для иммунодиагностики кандидоза//ЖМЭИ. - 1990. - 7. с.104-110,трихофитии крупного рогатого скота Патент 24954 Республики Казахстан. МПК 01 33/577 01 33/569. Способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота/Кухар Е.В.,Киян,Куйбагаров М.А., Боровиков С.Н. заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - 2009/0084.1 заявл. 20.01.2009, опубл. 15.11.2011. Бюлл. 11. с.5,руброфитии человека Патент 24441 Республики Казахстан. МПК 12 5/10 С 12 Р 21/08 01 33/577 01 33/569. Способ диагностики руброфитии/Акимбаева А.К. Кухар Е.В.,Муканов К.К., Сураншиев Ж.А. заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - 2009/1106.1 заявл. 03.09.2009, опубл. 15.08.2011. Бюлл. 8. с.4. Получены моноклональные антитела,с использованием которых совершенствуются иммуноферментные тесты для диагностики микроспории или проводится идентификация возбудителей.,Т.,.,// . . - 1995. - . 46,. 4. - . 435-444. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является иммуноферментный анализ,разработанный Кухар Е.В. с соавт. Ин. патент 20706 Республики Казахстан. МПК 01 33/53 А 61 39/00. Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота/Кухар Е.В., Муканов К.К.,Шенжанов К.Т., Ескендирова С.З. заявитель и патентообладатель Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина. - 2007/1240.1 заявл. 10.10.2007, опубл. 15.01.2009. - Бюлл. 1. с.3, который предназначен для диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Непрямой вариант ИФА выявляетк антигенам Т..130 у 91 больных трихофитией животных, что свидетельствует о высокой чувствительности, подтверждает наличие клинических признаков и позитивные показания РА, 30026 является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики. Однако известный способ диагностики имеет недостатки он предназначен для работы с крупным рогатым скотом, возбудителем заболевания у скота является,имеющий определенный антигенный состав, а возбудителем микроспории плотоядных является. Этот дерматомицет имеет другой антигенный состав, к тому же он имеет биологические особенности в строении макроконидий, является опасным зооантропонозным заболеванием,передающимся от животных человеку. Технической задачей изобретения является разработка иммуноферментного анализа для совершенствования диагностики микроспории плотоядных, которая достигается тем, что при постановке иммуноферментного анализа в качестве антигена для сенсибилизации полистиролового планшета используют антиген клеточной стенки грибаМ-58-13/, а выявление в сыворотке крови кошек и собак специфичных к названному антигену антител класса,образование которых характерно для инфекционного процесса при микроспории,осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина оптической плотности которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Подбирают оптимальную концентрацию антигена для постановки ИФА,используя сыворотки крови иммунных мышей Определение оптимальной концентрации антигена дерматомицета М.-58-13/ при постановке ИФА Концентрация антигена (мг/мл) Антисыворотки белых беспородных мышей Проба 1 Проба 2 Проба 3 титр антител ОП титр антител ОП титр антител 1800 0,398 1400 0,487 11600 13200 0,678 13200 0,828 16400 13200 0,506 1800 0,914 16400 ОП 0,005 0,772 0,01 0,791 0,02 1,235 Примечания 1) значение экстинкции отрицательного контроля - 0,067 2) ОП сывороток представлены при разведении 1100. Как видно из таблицы 1, высокие показатели ОП при анализе результатов ИФА в разведении сывороток 1100 регистрируются при использовании антигена в концентрации 0,01 и 0,02 мг/мл. Так как титр специфических антител, выявленный в сыворотках крови иммунных мышей антигенами в концентрации 0,01 и 0,02 мг/мл, практически одинаков, это указывает на возможность их применения в концентрации 0,01 мг/мл. Пример 2. Определение рабочего титра коммерческого препарата конъюгата (производство ), содержащего антивидовые антитела к иммуноглобулинам классапротив возбудителя микроспории, методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. Для постановки ИФА испытывали разведение конъюгата 15 000, 110 000, 115 000 (таблица 2) Таблица 2 Результаты анализа конъюгата - с сыворотками крови кошек в непрямом варианте ИФА Разведение конъюгата 15 000 110 000 115 000 Титр специфических антител К Показатель ОП К 13200 1800 1400 За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение, которое выявляеткошек в концентрации не ниже 20-40 нг/мл. По данным таблицы 2, применение конъюгата в разведении 15000 позволяет получить результаты в 1,5-2 раза превышающие аналогичные по показанию ОП при других разведениях конъюгата. Пример 3. Определяют оптимальные параметры постановки и учета результатов непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител против микроспории в сыворотке крови кошек, в котором используется антиген гриба-58-13/. Для постановки ИФА в ячейки 96-луночного плоскодонного планшета для микротитрования иммобилизуются антиген в концентрации 0,01 мг/мл в забуференном физиологическом растворе с 7,2-7,4 (ЗФР) при температуре 4 С в течение ночи или при 37 С в течение 2 часов. После удаления несвязавшегося антигена путем последовательной 3 кратной отмывки ЗФР с твином-20 (ЗФР-Тв) в ячейках готовятся двукратные разведения испытуемых сывороток крови (1100 и выше). В качестве отрицательного контроля используется сыворотка крови здоровых кошек. В качестве положительного контроля используется сыворотка крови кошки с клинически выраженной микроспорией, в которой подтверждено наличие специфических антител. Все компоненты реакции используются в объме 0,1 мл. После инкубации в течение 1 часа при 37 С планшет отмывается вышеописанным способом и вносятся антитела против иммуноглобулинов кошек,меченные пероксидазой хрена,в рабочем разведении. Через 1 час носитель вновь отмывается и в ячейки вносится раствор субстрата, состоящего из перекиси водорода и хромогена - ТМБ в 1 растворе лимонной кислоты ( 4,2). Результаты анализа учитываются на спектрофотометре при длине волны 492 нм либо визуально после остановки реакции стоп-реагентом. Результаты учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной отрицательной сывороткой(К-), контроля конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой (К) не менее 0,5 о.е. Реакцию считают положительной, если значения экстинкции исследуемых сывороток в два и более раза превышают величину ОП отрицательного контроля. При визуальном учте реакции сравнивают содержимое лунок с исследуемыми сыворотками крови животных и содержимым лунок с положительным контролем. При наличии специфических антител к возбудителю микроспории содержимое лунок с исследуемыми сыворотками имеют желто-коричневое окрашивание, сравнимое с цветом окрашивания в лунках с положительной сывороткой. В зависимости от поставленной цели исследования проб испытуемых сывороток можно проводить двумя способами без титрования и с титрованием. Если исследование проб сывороток крови проводится без титрования, то это дает возможность провести качественную оценку результатов реакции ИФА по принципу - положительная реакция (в пробе выявлены специфические антитела к возбудителю микроспории) или отрицательная реакция (в пробе сыворотки нет специфических антител). При качественной постановке реакции(ответ есть или нет) учет результатов ИФА проводят визуально по появлению окрашенного продукта ферментативной реакции. Выявление от светло-желтого до интенсивного желто-коричневого окрашивания считается положительным результатом. Если исследование проб сывороток крови проводится с титрованием, то это дает возможность выявить и учесть титры специфических антител,выявленные у кошек к возбудителю микроспории и дать ориентировочную количественную оценку результатов реакции. Для этого в ряду лупок с разведением испытуемой сыворотки находим отчетливо выраженный переход от интенсивного окрашивания к незначительному, фоновому. В лунках с разведением контрольной положительной сыворотки находим лунку с близким по концентрации цветом и принимаем ее за идентичный результат. Находим значение титра антител в положительном контроле. Поднимаясь вверх по ряду контрольной положительной и испытуемой сывороток,отсчитываем соответствующее разведение и находим титр специфических антител в испытуемой сыворотке. Пример 4. Проводили определение диагностической ценности непрямого варианта ИФА для выявления специфических антител к М.в сыворотках крови кошек, иммунизированных вакциной Вакдерм или имеющих клинические признаки микроспории (таблица 3). Таблица 3 Анализ сывороток крови кошек в ИФА с антигеном дерматомицета-58-13/ Сыворотки крови Клинически здоровые животные Клинически больные животные Вакцинированные животные Негативная сыворотка (К-) Титры специфических антител / 1100 / 1400 1200 / 16400 1100/ 1800 РО/ 1100 Данные таблицы 3 свидетельствуют о циркуляции специфических антител к возбудителю микроспории в сыворотках крови кошек, что может служить важным диагностическим показателем при постановке диагноза на микроспорию. У иммунизированных животных показатели титров антител находились в пределах 1100-1800 (средний 4 Средний титр антител 11600,44 111430,43 12100,34 1500,55(средний титр - 111430,43). Пример 5. Определение диагностической ценности непрямого варианта ИФА для выявления специфических антител к М. , проводили постановкой непрямого варианта ИФА с сыворотками крови собак, имеющих клинические признаки микроспории (таблица 4). Таблица 4 Анализ сывороток крови собак в ИФА с антигеном дерматомицета-58-13/ Сыворотки крови Клинически здоровые животные Клинически больные животные Позитивная сыворотка (К) Негативная сыворотка (К-) Титры специфических антител / 1200 / 1400 1800 /13200 16400 РО Средний титр антител 12250,19 115040,33 132000,55 1460,17 Данные таблицы 4 свидетельствуют о наличии специфических антител к возбудителю микроспории в сыворотках крови собак, что позволяет использовать ИФА в диагностике болезни. Средний титр антител у клинически больных собак 180013200 (средний тигр - 115040,33), что в 6,68 раз выше показателя титров антител здоровых животных и позволяет достоверно выявить животных, зараженных дерматомицетом М. . Пример 6. Оценивают чувствительность предложенного способа диагностики микроспории плотоядных в сравнении с наличием клинических признаков и в реакции агглютинации в микроварианте (РМА) (таблица 5). Таблица 5 Изучение специфичности иммуноферментного анализа с другими методами диагностики микроспории кошек Клинически здоровые животные, не иммунизированные Клинически здоровые животные, не иммунизированные Вакцинированные двукратно животные, кровь отобрана на 21 сутки Клинически больные животные,иммунизированные 1 - или 2 кратно Клинически больные животные,не иммунизированные, лечение фунгицидами Отрицательный контроль Положительный контроль Клинические Капельный вариант РА Непрямой вариант ИФА признаки Наличие выявления ия выявления выявления нет 0 слабо 18,2 11600,44 45,5 выражена Как видно из таблицы 5, предложенный способ диагностики микроспории является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики клиническим и серологическим (РА). В ИФА процент выявления больных животных составил 88, клиническим методом - 30, в реакции микроагглютинации 74. Наиболее показательные результаты получены по группе клинически здоровых животных,находившихся в питомнике при отсутствии клинических признаков в группе кошек выявлены высокие титры специфических антител к возбудителю микроспории, как в РМА, так и в ИФА. На основании экспериментальных данных были установлены показатели титра специфических антител сывороток крови плотоядных в непрямом варианте ИФА- 1200 - достаточный титр специфических поствакцинальных антител, свидетельствующих о выработке иммуноглобулинов у вакцинированных животных также подозреваемые в заражении невакцинированные животные с обязательным повторным анализом сыворотки крови в ИФА через 2 недели- 1400 - животные, подозреваемые в заражении и/или в переболевании микроспорией,с обязательным повторным анализом сыворотки крови в ИФА через 2 недели и применением комплекса лечебно-профилактических мероприятий- 1800 и выше - явно больные животные,требующие проведения дезинфекции, а также применения комплекса лечебно-профилактических мероприятий с назначением фунгицидных и/или фунгистатических препаратов местного и системного действия. Использование предлагаемого варианта твердофазного иммуноферментного анализа в ветеринарной практике позволит повысить 5 эффективность проводимых мероприятий за счет мониторинга иммунного фона и ранней диагностики микроспории плотоядных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ серологической диагностики микроспории плотоядных,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном и выявление в сыворотке крови кошек специфичных к названному антигену антител класса, образующихся при микроспории, с помощью меченных ферментом пероксидазы хрена иммуноглобулинов кролика против видового анти кошек, отличающийся тем, что в качестве антигена используют растворимые компоненты клеточной стенки дерматомицетаМ-58-13/, при этом все компоненты реакции используют в объеме 0,1 мл и учет результатов проводят на спектрофотометре или визуально по окрашиванию реакционной смеси в сравнении с положительным и отрицательным контролями.