Способ криосохранения консорциума фототрофных микроорганизмов

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ сохранении жизнеспособности, упрощение и удешевление способа их хранения. Способ криосохранения фототрофных микроорганизмов включает суспендирование биомассы до конечной влажности концентрации 12-14, и обработку криопротектором, после чего полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки,выдерживают при температуре 4-6 С в течение 1 ч,затем замораживают при температуре -20 С и хранят до размораживания. Предлагаемый способ криосохранения фототрофных микроорганизмов перспективен,эффективен и экономичен, поскольку в данном способе криоконсервации используется существенно более высокая температура хранения(-20 С), которая может быть обеспечена простым морозильным оборудованием, по сравнению с жидким азотом (-195 С) и специализированными морозильными камерами (-80 С) и кроме того, сам процесс замораживания более упрощен в выполнении. Кроме этого необходимо отметить, что данный способ криосохранения предлагается для хранения корсорциума фототрофных микроорганизмов,поскольку, как известно, по сравнению с монокультурами консорциум более технологичен в практическом использовании, менее подвержен контаминациям со стороны посторонней микрофлоры.(72) Заядан Болатхан Казыханович Садвакасова Асемгуль Калыйкумаровна Кирбаева Дарига Кенжебаевна Акмуханова Нурзия Рахмедиевна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологии и биотехнологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ КРИОСОХРАНЕНИЯ КОНСОРЦИУМА ФОТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, к способам хранения консорциума фототрофных микроорганизмов, в частности азотофиксирующих цианобактерий для получения концентрированного посевного материала и решения проблемы сохранения их биоразнообразия. Достигаемый технический результат увеличение продолжительности хранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов при Полезная модель относится к биотехнологии, в частности к способам хранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов (микроводорослей и цианобактерий) в замороженном состоянии,обеспечивающем в наибольшей степени длительное сохранение ими жизнеспособности и пролиферативной способности. Изобретение может быть использовано для хранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов в коллекциях, на производстве и в научноисследовательской практике. В настоящее время хранение фототрофных микроорганизмов в жизнеспособном состоянии осуществляется в коллекциях культур, которые создаются в большинстве микробиологических лабораторий и на биотехнологических производствах и используются как в промышленных, так и в исследовательских целях. Главной задачей консервации фототрофных микроорганизмов является обеспечение их долгосрочного хранения с поддержанием высокой жизнеспособности и предупреждением мутационных изменений, то есть в состоянии максимально близком к естественному. Известно, что при хранении фототрофных микроорганизмов помимо потери клетками жизнеспособности также имеют место процессы популяционной изменчивости. При этом доминантный фенотип замещается другими с измененными исходными свойствами и продуктивностью, происходит потеря клетками хранящейся культуры приоритетных свойств(А.А. Цуцаева, А.Е. Ананьина, Л.М. Балыбердина,Л.В. Степанюк, Н.В. Павленко. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов // Микробиология. - 2008.- Т.77,5. - С.696-700). В этой связи очевидна потребность в использовании эффективных способов хранения в условиях специализированных коллекций,производственных и научно-исследовательских лабораторий клеток микроводорослей и цианобактерий, которые могут представлять коммерческий интерес, в частности, в качестве источника получения биомассы, являющейся возобновляемым сырьем для сельскохозяйственной, нефтехимической, и пищевой промышленности. При этом одним из основных условий применения того или иного способа хранения клеток фототрофных микроорганизмов является адекватный выбор условий их хранения,обеспечивающих длительное сохранение клетками своих популяционных характеристик и максимально возможного уровня жизнеспособности. Известен способ криосохранения морских микроводорослей криопротекторной смесью,содержащей проникающий и непроникающий криопротекторы и питательную среду (Патент 2496318 РФ, МПК 01/02, опубл. 27.10.2013 г.),в котором осуществляют замораживание с последующим сохранением в жидком азоте. В качестве питательной среды берут стерильную морскую воду при следующем соотношении 2 компонентов в масс. проникающий криопротектор 5-7,5 непроникающий криопротектор 1,5-3 стерильная морская вода остальное. Перед замораживанием проводят инкубацию клеток морских микроводорослей на ледяной бане в течение не менее 10 минут. Замораживание ведут в три этапа сначала охлаждают до -25 С со скоростью 0,9-1,1 С/мин затем охлаждают до -75 С со скоростью 2-2,5 С/мин после чего охлаждают до -196 С,помещая клетки морских микроводорослей в жидкий азот. В качестве проникающего криопротектора используют диметилсульфоксид(ДМСО) или этиленгликоль. В качестве непроникающего криопротектора - трегалозу или поливинилпирролидон (ПВП). Недостатками этого способа являются длительность процесса криоконсервации(трегалоза, ДМСО), присутствие которых может приводить к контаминации образца при его размораживании, что также является существенным недостатком. Кроме того, к недостаткам этого способа следует отнести необходимость использования сложной аппаратуры для контролируемого замораживания,а также отсутствие информации о выживаемости клеток при их хранении при таком способе криоконсервации. Известен способ криосохранения фототрофных клетокССАР 66/4 с использованием режима двухстадийного замораживания, согласно которому биомассу подвергают замораживанию в присутствии 5 глицерина,используемого в качестве криопротектора, при скорости замораживания 5 С/мин до -30 С с 10-минутным периодом установления равновесия при этой температуре перед помещением замороженного материала в жидкий азот ( С.,// . . . - 1992. -4. - . 105109). В этих условиях жизнеспособность размороженных клеток составляет 65 от исходного уровня. К недостаткам данного способа относится необходимость использования сложного оборудования, обеспечивающего программируемое снижение температуры, отсутствие информации о жизнеспособности замороженных таким способом клеток при длительном хранении. Все эти способы дороги ввиду необходимости использования энергоемкого и дорогостоящего криогенного оборудования,обеспечивающего поддержание температур жидкого азота и большого расхода жидкого азота, ввиду того, что при хранении образцов в жидком азоте существует необходимость его периодического добавления в емкости для хранения так как он, улетучиваясь,постепенно расходуется, требуя таким образом дополнительных экономических затрат на его пополнение. Наиболее близким является способ криосохранения клеток фототрофных микроорганизмов (Патент 2508397 РФ, МПК 12 1/04, 12 11/04, опубл. 27.02.2014 г.),включающий суспензирование биомассы клеток до концентрации 15-30 мас. в растворе поливинилового спирта с концентрацией 6-9 мас.,приготовленном на питательной среде,специфичной для выращивания конкретного фототрофного микроорганизма,являющейся криопротектором, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии объемом 0,1-0,5 см 3 при -80-70 С. Способ позволяет упростить процесс криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов, увеличить выживаемость клеток до 90-95, обеспечить этот уровень выживаемости при хранении клеток в течение срока до полутора лет и использовать размороженные образцы клеток в качестве концентрированного посевного материала. Недостатками этого способа являются-применение данного способа хранения только для монокультур фототрофных микрорганизмов-необходимость использования энергоемкой и дорогостоящей криогенной морозильной камеры- недолгий срок хранения (в течение полутора лет). Задачей предлагаемой полезной модели является создание эффективного и практически доступного способа криосохранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов азотфиксирующиих цианобактерий и. Техническим результатом является увеличение продолжительности хранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов при сохранении жизнеспособности, упрощение и удешевление способа их хранения. Технический результат достигается предлагаемым способом криосохранения фототрофных микроорганизмов,включающим суспендирование биомассы,обработку криопротектором, замораживание и хранение, но в отличие от известного биомассу суспендируют до конечной влажности концентрации 12-14, в качестве криопротектора используют стерильную смесь, включающую 10-ный раствор селенита натрия, 5-ный раствор сахарозы и 5-ный раствор глицерина,замораживают предварительно выдержанную при температуре 4-6 С в течение 1 ч биомассу при температуре -20 С и хранят до размораживания. В качестве криопротектора используют глицерин в сочетании с сахарозой и селенитом натрия. Глицерин в сочетании с сахарозой предотвращает образование больших кристаллов воды,разрушающих клетки фототрофных микроорганизмов и удерживает влагу, легко проходящую через клеточную мембрану, и тем самым обеспечивает как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замараживания, что в итоге способствует предотвращению высокой смертности клеток фототрофных микроорганизмов. Кроме этого, микроэлемент селен, содержащийся в используемом соединении, способен увеличивать активность практически всех звеньев антиоксидантной системы фототрофных микроорганизмов без негативного воздействия на ферментативный аппарат. Это позволяет не только сохранить все позитивные свойства организмов в течение длительного периода времени хранения без пересева, но и в ряде случаев увеличить их. Преимуществом используемых в качестве криопротектора соединений является то, что они не проявляют цитотоксичность и являются потенциально легко биодеградируемыми субстратами. Предлагаемый способ криосохранения фототрофных микроорганизмов перспективен,эффективен и экономичен, поскольку в данном способе криоконсервации используется существенно более высокая температура хранения(-20 С), которая может быть обеспечена простым морозильным оборудованием, по сравнению с жидким азотом (- 195 С) и специализированными морозильными камерами (-80 С) и кроме того, сам процесс замораживания более упрощен в выполнении. Кроме этого необходимо отметить, что данный способ криосохранения предлагается для хранения корсорциума фототрофных микроорганизмов,поскольку, как известно, по сравнению с монокультурами консорциум более технологичен в практическом использовании, менее подвержен контаминациям со стороны посторонней микрофлоры и поражению бактериофагами. В отличие от аналогов и прототипа, заявляемое техническое решение позволяет сразу же использовать размороженные образцы клеток консорциума в качестве концентрированного посевного материала для выращивания консорциума фототрофных микроорганизмов. Заявляемое техническое решение позволяет увеличить выживаемость клеток различных фототрофных микроорганизмов в процессе их замораживания-оттаивания до 95,0 и сохранить этот высокий уровень жизнеспособности,конролируемый традиционными микробиологическими и альгологическими методами, в течение срока, составляющего до 3 лет. Таким образом,благодаря заявляемому техническому решению может быть существенно упрощено по реализации и улучшено по характеристикам(выживаемости клеток) криосохранение консорциума фототрофных микроорганизмов. Особенность технического решения состоит в том,что увеличение сроков хранения жизнеспособной культуры достигается без дополнительных экономических затрат в связи с тем, что необходимое количество вносимых веществ(селенита натрия, глицерин, сахароза) очень мало. Определение потенциальной активности азотфиксации консорциума фототрофных микроорганизмов проводят ацетиленовым методом,который основан на способности нитрогеназы 3 восстанавливать ацетилен до этилена в количестве,пропорциональном количеству азота, которое может быть восстановлено в тех же условиях. Оценку биоактивности (азотофиксирующей) консорциума фототрофных микроорганизмов проводят сразу после активирования продуцента размораживанием при температуре 38-40 С. Способ поясняется следующими примерами,иллюстрирующими способ замораживания и хранения консорциума фототрофных микроорганизмов в смеси биомассы и защитной среды. Пример 1. Культивирование азотфиксирующих цианобактерий в лабораторных условиях Для хранения используют консорциум на основе азотфиксирующих цианобактерий(и) из коллекции лаборатории фототрофных микроорганизмов кафедры биотехнологии Казахского национального университета им. аль-Фараби, задепонированные в РГП на ПХВ РКМ КН МОН РК под номерами 0679,78. Для получения консорциума фототрофных микроорганизмов родаи(компоненты консорциума смешивают в соотношение 11) культивировируют на питательной среде Громова 6. Рост клеток фототрофных микроорганизмов осуществляют в течение 14 суток при освещении 4000500 лк. При достижении стационарной фазы роста клеток консорциума фототрофных микроорганизмов суспензию отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (3500 20 мин), суспендируют до конечной влажности концентрации 12-14,после чего осадок, содержащий биомассу,смешивают с защитной стерильной средой,включающей 10-ный водный раствор селенита натрия, 5-ный водный раствор сахарозы и 5-ный водный раствор глицерина. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки,охлаждают при температуре 4-6 С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре -20 С и хранят при данной температуре до размораживания. Выживаемость клеток фототрофных микроорганизмов после размораживания составляет 95 и сохраняется на этом уровне в течение 3 лет. Таблица 1 Жизнеспособность клеток консорциума азотофиксирующих цианобактерий до и после криосохранения Культуры Сроки хранения культуры консорциума , месяцы входящие в 6 12 24 консорциум К О К О К О К 100 95,8 100 95,6 100 95,3 100 иПримечание К - (контроль) до криосохранения, О - (опыт) после криосохранения Пример 2. Исследование азотофиксирующей активности консорциума фототрофных микроорганизмови Оценку качества замороженного биоматериала через 1 год (3 года) хранения после оттаивания проводят путем сравнительного определения количества жизнеспособных клеток индикаторных азотофиксирующих цианобактерий в образцах до и после криоконсервации общепринятыми микробиологическими методами. Активность нитрогеназы определяют ацетиленовым методом (., 1968) на газовом хроматографе Цвет-500. ( , 36 О 95,0,Е.К..2-//. - 1968. - 8. -. 43. - . 1185-1207). Культуры выращивают при 21-23 в люминесцентном освещении с интенсивностью 3000500 лк на среде -11 (без добавления нитратов) в течение 14 дней. После культивирования консорциума в 1 мл пробы было выявленно содержание азота - 0,19 кислорода(азотофиксирующей) консорциума фототрофных микроорганизмов после криосохранения в течение 3 лет приведена в таблице 2. Таблица 2 Показатели нитрогеназной активности консорциума азотофиксирующих цианобактерий после криосохранения Культуры Сроки хранения культуры консорциума (мг/г), м входящие в 6 12 консорциум К О К О 0,152 0,168 0,1340,004 0,1750,005 и 0,006 0,007 Примечание К - (контроль) до криосохранения, О - (опыт) после криосохранения 4 Из вышеприведенных примеров видно, что наилучшие результаты по выживанию и восстановлению культур фототрофных микроорганизмов получены в случае инкубации медленного охлаждения клеток, поскольку только постепенное замораживание обусловливает повышенную резистентность клеток микроорганизмов к повреждающим факторам замораживания, и способствует тем самым сохранению их морфологических признаков,физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности при длительном хранении в замороженном состоянии. Предлагаемый способ позволяет упростить процесс криосохранения клеток консорциума фототрофных микроорганизмов,увеличить выживаемость клеток до 95, обеспечить этот уровень выживаемости при хранении клеток в течение срока до 3 лет. ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Способ криосохранения консорциума фототрофных микроорганизмов,включающий суспензирование биомассы,обработку криопротектором, замораживание и хранение,отличающийся тем, что биомассу суспендируют до конечной влажности концентрации 12-14, в качестве криопротектора используют стерильную смесь, включающую 10-ный раствор селенита натрия, 5-ный раствор сахарозы и 5-ный раствор глицерина,замораживают предварительно выдержанную при температуре 4-6 С в течение 1 ч биомассу при температуре -20 С и хранят до размораживания.