Основа питательной среды для выделения трихомонад

(51) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ эстеразы,лактазы,щелочную фосфатазу,трансаминазу, инвертазу и др.), витамины А, В 1, В 2,В 6, С, Д, Е), стероидные гормоны, микроэлементы и другие биологические активные вещества. Разработанная нами питательная среда из водного экстракта плаценты человека позволила получить достаточно высокий процент выделения трихомонад. Помимо высоких элективных свойств разработанная питательная среда экономична,проста в приготовлении, так как используется плацента человека, которая большей частью подвергается утилизации. Применение более доступных обладающих высокими ростовыми свойствами питательных сред для диагностики трихомоноза позволит решить задачу по расширению культуральной диагностики трихомоноза, оптимизации качества исследования в лечебно-профилактических учреждениях акушерско-гинекологического, урологического и кожно-венерологического профиля Республики Казахстан.(72) Рамазанова Бахыт Аманулловна Акышбаева Кульбаршин Сабировна Маматова Алия Серикжановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) ОСНОВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ТРИХОМОНАД(57) Полезная модель относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано для культуральной диагностики трихомоноза. Основой питательной среды является водный экстракт плаценты человека. Плацента содержит липиды, РНК, ферменты (протеазы, 1566 Полезная модель относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано для культуральной диагностики трихомоноза. Основой питательной среды является триптический перевар плаценты человека. Плацента содержит липиды, РНК, ферменты (протеазы,эстеразы,лактазы,щелочную фосфатазу,трансаминазу, инвертазу и др.), витамины А, В 1, В 2,В 6, С, Д, Е), стероидные гормоны, микроэлементы и другие биологические активные вещества. Значимость предлагаемого изобретения обоснована приоритетностью охраны репродуктивного здоровья населения Республики Казахстан. Одной из ведущей детерминант репродуктивного здоровья населения являются инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в структуре которых урогенитальный трихомоноз(УГТ) занимает ведущее положение (до 50) с преобладанием бессимптомной и недиагностированной форм, микст-инфекций, что приводит к росту осложнений с развитием вторичного бесплодия, а также к трудности диагностики. К настоящему времени в РК сложилась парадоксальная ситуация при достаточно высоком уровне УГТ, отсутствует производственный выпуск стандартных питательных сред для культуральной диагностики. В практическом здравоохранении диагностика УГТ основывается в основном на микроскопических методах, диагностическая ценность которых незначительна. Культуральная диагностика,являющаяся золотым стандартом, широко не проводится,в основном из-за отсутствия отечественных питательных сред. Используются дорогостоящие питательные среды импортного производства. Все это обуславливает актуальность поставленной задачи улучшение качества лабораторной диагностики на основе совершенствования культурального метода диагностики. В состав основы известных применяемых сред зарубежного производства входят дорого стоящие ингредиенты(мясопептонный бульон, препараты печени,сыворотка крови человека или животных и др.). Наиболее близким аналогом разработанной нами среды с основой из плацентарного инфуза является среда Джонсона-Трасселя ( и , 1940). Она известна как среда(где С солянокислый цистеин, Р - пептон, Г - печеночный настой, М - мальтоза). Основой среды является печеночный экстракт. В ее состав входит раствор Рингера, пептон, агар-агар, солянокислый цистеин,мальтоза, 0,5 раствор метиленовой сини,среды 5,8-6,0. В модификации ЦНИИКВИ она получила название среда СКДС Дмитриев Г.А.,Глазко И.И. Диагностика инфекций, передаваемых половым путем. - М., 2007. - 320 с В состав этой среды входят смесь гидролизата казеина и гидролизина или аминопептида,отходы фармацевтической промышленности при изготовлении лизоцима,ферментативный 2 гидролизат биомассы микроорганизмов, а также экстракт кормовых дрожжей. Данная питательная среда выбрана в качестве ближайшего аналога изобретения. Предложена также среда СГДС, состоящая из 100 мл указанного выше солевого раствора, 10 мл 5 гемогидролизата для культуры ткани, 10 мл дрожжевого аутолизата, 30 мл лошадиной сыворотки, 10 мл 20 раствора мальтозы,пенициллина и стрептомицина Методические рекомендации по приготовлению новых питательных сред для культуральной диагностики трихомоноза утверждены Министерством здравоохранения СССР 18.04.77 г. 10-8/23 Дмитриев Г. А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. Москва Медицинская книга,Н.Новгород Издательство НГМА, 2003. С.180-181. Известна среда Петровского с основой из водного экстракта печени с добавлением 1 пептона, 0,5 , 1 мальтозы. Известна среда(номер по каталогу 211747), содержащая бычий экстракт, дрожжевой экстракт, панкреатический казеин, -цистеин, мальтозу, агар, хлорамфеникол,метиленовый синий. Основой данных питательных сред являются дорогостоящие компоненты животного происхождения (пептический перевар животной ткани, печеночный перевар, бычий экстракт и др.). Питательные среды Джонсона-Трасселя, СГДС являются дорогостоящими зарубежного производства,не доступны практическим лабораториям. К недостаткам указанных сред можно отнести- использование дорогостоящих компонентов животного происхождения,что определяет дороговизну основы сред- недостаточно высокий и недостаточно быстрый рост биомассыЗадача заявленной полезной модели заключается в создании новой питательный среды с основой из водного экстракта плаценты, что позволит минимизировать стоимость питательной среды с увеличением элективных свойств для выделения трихомонад. Технический результат включает в себя разработку основы питательной среды из водного экстракта плаценты человека,обычно подвергающей утилизации, применение которой значительно повышает процент выделения Т.из биологического материала, что особенно важно при высокой частоте бессимптомных форм урогенитального трихомоноза. Указанный технический результат достигается в результате использования в качестве основы питательной среды водный экстракт плаценты человека, богатой липидами, РНК, ферментами,витаминами (А, В 1, В 2, В 6, С, Д, Е), стероидными гормонами, микроэлементами и рядом других биологически активных веществ. Основа среды из плаценты человека заменяет пищевые ингредиенты,являющиеся основой элективных питательных сред(например, среда Джонса и Трасселя). В связи с этим разработана методика приготовления питательной среды с основой из непищевого сырья(плацента человека). Технический результат заключается также в повышении скорости роста биомассы(число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигает 5104 особей в 1 мл среды). Для приготовления питательной среды используется свежая плацента женщин, не принимавших антибиотиков и сульфаниламидных препаратов. В условиях соблюдения асептики и антисептики плаценту освобождают от хориальной и амниотической оболочек, отмывают от крови и околоплодной жидкости. Из плаценты,освобожденной от хориальной и амниотической оболочек готовят фарш, который заливают водопроводной водой 12, тщательно размешивают и оставляют на 18 часов при 40 С. Затем фарш постоянно помешивая, нагревают до 960 С и выдерживают при этой температуре 45 минут. Сваренный фарш отжимают, полученную воду доводят до первоначального объма, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 1 атм 15 мин. Хранят в холодильнике. Основной состав среды для выделения трихомонад с основой из плацентарного инфуза- 0,12 г. Растворить в 100 мл, доводят объем до 1000 мл- 0,5 водный раствор метиленовой сини 0,5 мл- 25 водный раствор мальтозы - 100 мл- сыворотка крупного рогатого скота на 100 мл среды 30 мл- стрептомицин, пенициллин - 8000 ЕД Предлагаемая среда была апробирована в Казахском Национальном медицинском университете им. С.Д.Асфендиярова. Ниже приводятся результаты апробации. Пример 1. Способ определения элективных свойств среды с основой из плацентарного инфуза. Для определения элективных свойств разработанной среды проведено клиниколабораторное обследование 84 лиц, направленных из акушерско-гинекологических учреждений г. Алматы с диагнозом обследование. Забор и подготовка материала из очагов поражения (уретра,влагалище) была в соответствии с общепринятыми. В качестве контрольных сред применяли среду Джонсона-Трасселя и среду СКДС. Результаты исследования отражены в таблице 1. Таблица 1 Питательные СКДС СредаДжонсонаТрасселя Среда с основой из плацентарного инфуза Как видно из таблицы 1, трихомонады были выделены в следующих частотных пределах 33,3 36,9. Использование питательной среды с основой из плацентарного инфуза позволило получить процент выделения 35,75,2, что сопоставимо с показателем элективной среды Джонсона-Трасселя и превышает на 12 показатель СКДС. Пример 2. Оценка ростовых свойств разработанной питательной среды. Анализ проведен на основе анализа морфофункциональных свойств (форма, наличие органоидов, подвижность), интенсивности роста(число простейших в поле зрения) Во все сравниваемые питательные среды вносили равные количества инокулюма,содержащего жизнеспособные простейшие со следующей характеристикой 5 в поле зрения, Выделены процент активноподвижных более 70. Всего было изучено 42 штамма . Через 24 часа инкубирования при температуре 37 С проводили тестирование на подвижность. Испытуемая питательная среда позволяет создать благоприятные условия для роста . активноподвижные трихомонады составили в среднем 59,7, что на 8,3 больше, чем на среде СКДС. Сохранение форм . у 82,4 простейших. При оценке следующего параметра (количество жизнеспособных трихомонад) определена такая же тенденция. На плацентарной среде с данными показателями количество штаммов . составило 78,5 против 73,8 на СКДС. Таблица 2 Количественная характеристика подвижности .Питательные среды ДжонсонаТрасселя СКДС Среда с плацентарнойо сновой Одним из важных критериев оценки диагностической эффективности плацентарного инфуза как основы среды для выделения и культивированияявлялась также оценка морфологических свойств культур. Типичные трихомонады имели округлую или овальную форму. Особи с типичной формой активно передвигались, совершая волнообразные движения жгутиками. Пример 3. Способ культивирования. На питательную среду с плацентарной основой,осуществляли посев штамма ,выделенного от больной со свежей трихомонадной инфекцией. Сравнительную оценку диагностической эффективности среды для выделения и культивированияпроводили путем подсчета количества выросших на среде простейших с использованием камеры Горяева через 18, 20, 24, 48, 72, 96, 120 часов после посева культур на среду. Методика подсчета живых микроорганизмов состояла в следующем пробирки с культурамиосторожно встряхивали для обеспечения полного перемешивания осадка,содержавшего трихомонады, с надосадочной культуральной средой с целью равномерного распределения трихомонад во всем объеме среды. Со дна пробирки со средой, содержавшей ,стерильной пастеровской пипеткой брался материал(1 капля), которым заполнялась камера Горяева и производился подсчет трихомонад в 5-и расположенных по диагонали больших квадратах,каждый из которых разделен на 16 маленьких квадратов. Количество трихомонад вычислялся по формуле Для того чтобы получить число трихомонад в одном миллилитре среды, числоумножалось на 1000, так как 1 мл 3 равен 1000 мм 3. Число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигало 5104 особей в 1 мл среды, в то время как при проведении опыта согласно прототипу установлено, что число трихомонад в культуре достигало 5104 особей в 1 мл среды,только через 24 часа инкубации. Как видно из выше представленных данных,разработанная нами среда с плацентарной основой по элективным свойствам сопоставима со средой Джонсона-Трасселя, являющейся классической средой, и превышает по некоторым показателям СКДС. Преимуществом предлагаемой среды является ускорение роста трихомонад по сравнению с ростом на среде СКДС в связи с тем, что разработанная среда содержит питательные компоненты,необходимые для роста эукариотических клеток, к которым и относятся трихомонады. Таким образом, разработанная нами питательная среда из водного экстракта плаценты человека позволила получить достаточно высокий процент выделения трихомонад. Помимо высоких элективных свойств разработанная питательная среда экономична, проста в приготовлении, так как используется плацента человека, которая большей частью подвергается утилизации. Применение более доступных обладающих высокими ростовыми свойствами питательных сред для диагностики трихомоноза позволит решить задачу по расширению культуральной диагностики трихомоноза, оптимизации качества исследования в лечебно-профилактических учреждениях акушерско-гинекологического, урологического и кожно-венерологического профиля Республики Казахстан. где- количество микроорганизмов в 1 мм 3 культуры а - количество микроорганизмов в 5-и больших квадратах б - число маленьких квадратов в 5-и сосчитанных больших квадратах 4000 - маленькие квадраты, объем которых всегда равен 1/4000 мм 3. Питательная среда для выделения трихомонад отличающаяся тем, что в качестве основы используют водный раствор плаценты человека,содержащая компоненты в следующем соотношении-0,5 водный раствор метиленовой сини 0,5 мл-25 водный раствор мальтозы - 100 мл-сыворотка крупного рогатого скота на 100 мл среды 30 мл