Способ приготовления питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля

(51) 01 9/00 (2010.01) 05 9/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ представляет собой новый способ быстрого размножения пробирочных растений картофеля. Задача изобретения - быстрое размножение пробирочных растений картофеляпри использовании оптимизированной питательной среды МС. Технический результат может быть достигнут при использовании безгормональной питательной среды МС, состоящей из следующих компонентов макросоли - 50 мг/л, микросоли - 1 мг/л, -хелат 5,0 мг/л, СаС 2 2 Н 2 О - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л,никотиновая кислота - 0,5 мг/л, сахароза - 25 г/л,глюкоза - 25 г/л, агар - 6 г/л,- 5,7-5,8 для ускорения роста и развития пробирочных растений картофеляза 14 дней. Достижения технического результата позволяет получать масштабированное количество безвирусных пробирочных растений для получения оздоровленного семенного материала картофеля.(72) Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Рахимжанова Айжан Осербаевна Магзумова Гульмира Козовна Каримова Венера Конысбаевна Каржауов Мирас Райымбекович Созинова Любовь Феодосьевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ПРОБИРОЧНЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый способ быстрого размножения пробирочных растений картофеля. Картофель относится к основному виду. семействаявляется многолетним травянистым растением, но в культуре его используют как однолетнее растение, так как весь его жизненный цикл, начиная от прорастания клубней до образования и развития новых клубней,проходит в один вегетационный период. Размножают картофель вегетативным путем клубнями, ростками, черенками. Семенами в основном размножают при выведении новых сортов. Картофель является одной из ведущих сельскохозяйственных культур во всем мире,который широко используется в различных целях как пищевая, техническая и кормовая культура. В Казахстане за последние годы средняя урожайность картофеля составляет 160 ц/га. Многие ценные сорта картофеля сильно поражаются грибными и вирусными болезнями, что приводит к снижению урожайности в 2-2,2 раза. Одним из путей решения данной проблемы является применение биотехнологических методов для получения оздоровленного семенного материала картофеля. В связи с этим научные исследования, посвященные получению оздоровленного семенного материала картофеля, становятся чрезвычайно актуальными для сельского хозяйства. Аналог изобретения. В данном направлении нами не найдено способа быстрого размножения пробирочных растений картофеляза 14 дней. Известен способ выращивания растительных культури питательная среда для его осуществления,которая заключается в приготовлении питательной среды и введении в нее биоингибитора(инсекто-акарицид),высадка экспланта и последующее культивирование. Питательная среда содержит макро-,микроэлементы, витамины, регуляторы роста и другие добавки, она отличается тем, что в питательную среду для выращивания растительных культурдополнительно добавляют инсектоакарицид из группы пиретроидов в количестве 20,01200,0 мг/л среды (Высоцкий В.А. Способ выращивания растительных культури питательная среда для его осуществления // Патент Российской Федерации 2063681, заявительВсероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства, дата начала действия патента 1992.10.01). Также из аналогичных изобретений известен способ приготовления питательной среды для культивирования биотехнологических объектов растений (безвирусные клоны растений картофеля),включающий подготовку исходных компонентов,дегидратацию, дозирование на порции, фасовку сухой питательной среды, гомогенизацию ее в воде и разлив в культуральные емкости. Из исходных компонентов готовят сухую питательную среду с полным набором необходимых составляющих, за исключением воды. Недостатком указанного 2 способа является то, что его можно использовать только в заводских условиях. При подготовке исходных компонентов растворы соединяют с носителем, при этом один раствор или несколько растворов исходных компонентов корректируют так, чтобы отрицательный десятичный логарифм активности ионов оксония готовой питательной среды соответствовал требованиям биотехнологического объекта в отношении кислотности, дегидратации (Донец Н.В. Способ приготовления питательной среды для культивирования биотехнологических объектов растений // Патент Российской Федерации 2005354, класс патента А 01 Н 4/00, 12 5/04, 01 31/00, номер заявки 4922527/13, дата подачи заявки 24.03.1991, дата публикации 15.01.1994). Отличие предлагаемого нами способа заключается в быстром росте пробирочных растений картофеляза 14 дней при оптимизации состава питательной среды Мурасиге и Скуга (МС). Задача изобретения - быстрое размножение пробирочных растений картофеляпри использовании оптимизированной питательной среды МС. Технический результат может быть достигнут при использовании безгормональной питательной среды МС, состоящей из следующих компонентов макросоли - 50 мг/л, микросоли - 1 мг/л, -хелат 5,0 мг/л, СаС 22 Н 2 О - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л,никотиновая кислота - 0,5 мг/л, сахароза - 25 г/л,глюкоза - 25 г/л, агар - 6 г/л,- 5,7-5,8 для ускорения роста и развития пробирочных растений картофеляза 14 дней. Достижения технического результата позволяет получать масштабированное количество безвирусных пробирочных растений для получения оздоровленного семенного материала картофеля. Пример 1. Подбор питательных сред для быстрого размножения пробирочных растений картофеля Получение безвирусного семенного материала картофеля биотехнологическими методами состоит из нескольких этапов 1. Вычленение апикальных меристем и получение из них меристемных линий 2. Тестирование меристемных линий на вирусную инфекцию 3. Микроклональное размножение пробирочных растений 4. Выращивание пробирочных растений картофеля в теплице или на аэропонной установке 5. Получение безвирусных миниклубней картофеля. На третьем этапе очень важно быстро размножить растения,чтобы с одного растения могли получить несколько тысяч пробирочных растений. Размножение пробирочных растений картофеля проводили путем микрочеренкования. Пробирочные растения картофеля доставали из пробирки пинцетом и клали на стерильный матрасик. Скальпелем разрезали растение на черенки, состоящий из кусочка стебля с листочком и пазушной почкой. Черенкование пробирочных растений проводили с интервалом 14 дней. Выросшие растения с 5-6 черенками периодически разрезали и пересаживали в пробирки со свежей питательной средой МС. Из этих черенков вырастали новые растения. Пробирочные растения выращивали в фактеростатной комнате при температуре 23-25 и освещенности 7000 люкс. Для быстрого роста пробирочных растений картофеля подбирали 5 вариантов питательных сред, за основу использовали питательную среду МС (таблица 1). Быстрое размножение пробирочных растений картофеля наблюдали на варианте среды В-8 (без гормонов), которая состояла из следующего состава макросоли - 50 мг/л (43- 650 мг/л,3- 1900 мг/л, 2 7 Н 2 О - 370 мг/л, КН 2 РО 4 170 мг/л), микросоли - 1 мг/л (Н 3 ВО 3 - 6,2 мг/л,442 - 22,3 мг/л, 4- 7 Н 2 О - 8,6 мг/л,0,83 мг/л, 2422 - 0,25 мг/л, 452 0,025 мг/л, СоС 126 Н 2 О - 0,025 мг/л), -хелат - 5,0 мг/л, СаС 22 Н 2 О - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л,тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л,никотиновая кислота - 0,5 мг/л, сахароза - 25 г/л,глюкоза - 25 г/л, агар - 6 г/л,5,7-5,8, по сравнению с другими вариантами сред она обогащена углеводами в 1,5 раза больше сахарозой Варианты питательных сред для микроклонального размножения пробирочных растений картофеля-хелат СаС 122 Н 2 О Мезо-инозит Тиамин Пиридоксин Аскорбиновая кислота Никотиновая кислота Гибберелловая кислота Пантотенат Са Аденин Глицин Глицерин Активированный уголь Гидролизат казеина ИУК Кинетин Сахароза Глюкоза Агар 5,6-5,8 Пример 2. Морфометрический анализ пробирочных растений картофеля В результате исследований провели сравнение роста пробирочных растений картофеля в зависимости от варианта питательной среды. При микроклональном размножении использовали два сорта картофеля Тохтар и Бакша. Пробирочные растения картофеля в стерильных условиях разрезали скальпелем на сегменты, которые затем пересаживали в пробирки с питательной средой МС(варианты сред В-8, В-10). Расчеренкованные растения картофеля выращивали в фактеростатной комнате при температуре 23-25 и освещенности 7000 люкс. При сравнении двух вариантов среды активный рост пробирочных растений картофеля наблюдали на питательной среде В-8 (таблица 2, рисунок 1). При использовании питательной среды В-8 у сорта Тохтар на 14-ый день культивирования высота растений составила 8,2 см количество листьев - 9,1 штук количество корней - 5,1 штук, а на варианте В-10 высота растений - 5,9 см количество листьев 6,1 штук количество корней - 5,5 штук (фиг. 2). Рост корней на этом варианте был активнее по сравнению со средой В-8. Следовательно,по морфометрическим показателям рост пробирочных растений картофеля при использовании варианта среды В-8 протекает активнее по сравнению со средой В-10. Таблица 2 Рост пробирочных растений картофеля на питательных средах Сорт Высота растений, см. 1 день 7 дней 14 дней Морфометрические показатели Листья, шт. 1 день 7 дней 14 дней Вариант среды В-8 1 6,3 1 5,8 Вариант среды В-10 1 4,8 1 4,1 Также по сорту Бакша пробирочные растения активно росли на варианте среды В-8. При проведении морфометрических замеров на 7-ой день культивирования, показано, что количество листьев в среднем 5,8 штук на одно растение (вариант В-8),на варианте среды В-10 - 4,1. При использовании питательной среды В-8 высота растений составила 3,8 см, а на среде В-10 - 3,1 см. Отсюда следует, что активный рост вегетативной части и корневой системы наблюдается при использовании питательной сред В-8. Пример 3. Определение вирусной инфекции методом иммуноферментного анализа (ИФА) Следующим этапом наших исследований было определение вирусной инфекции методами ИФА в меристемных линиях картофеля для размножения и получения миниклубней. Пробирочные растения картофеля проверяли на вирусы , , , (Таблица 3). Таблица 3 Определение вирусной инфекции методом ИФА в меристемных линиях картофеля Т 8 Т 9 Т 10 Примечания 1- вирус обнаружен 2 (-) - вирус отсутствует Для этого предварительно отобрали по 10 меристемных линий сорта Тохтар. Показано, что на линиях Т 1 и Т 3 был обнаружен вирус , а на линии Т 4 вирус . Меристемные линии картофеля, зараженные вирусной инфекциейибыли выбракованы. Отобранные чистые линии сорта Тохтар - Т 2, Т 5, Т 6, Т 7, Т 8, Т 9, Т 10 использовали в дальнейшем для получения пробирочных растений картофеля. Пример 4. Микроклональное размножение оздоровленного картофеля Для быстрого роста пробирочных растений картофеля за 14 дней нами оптимизирована питательная среда МС вариант В-8 (состав среды приведен в таблице 1). Подготовленной питательной средой В-8 проведено размножение пробирочных растений картофеля сортов Романо, Тохтар, Бакша,Невский для получения миниклубней картофеля(таблица 4). В результате микроклонального размножения получено 8133 штук пробирочных растений. Таблица 4 Микроклональное размножение пробирочных растений Сорт Романо Тохтар Бакша Невский Итого ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля,предусматривающий размножение растений,отличающийся тем, что размножение происходит за 14 дней, при этом используют оптимизированную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС),состоящей из следующих компонентов макросоли 50 мг/л- хелат 222 мезо-инозит тиамин пиридоксин никотиновая кислота сахароза глюкоза агар Фиг. 1 - Пробирочные растения картофеля сорта Тохтар