Способ изготовления аллергена из бруцелл

(51) 61 39/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ чувствительности и специфичност аллергена,получаемого из бруцелл. Способ изготовления аллергена из бруцелл,включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием, готовят взвеси бруцелл 50,0100,0 млрд концентрации из штаммов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270 на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения,после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт.(72) Иванов Николай Петрович Тен Виктор Борисович Намет Айдар Мырзахметович Оспанов Ержан Калиолдинович Арысбекова Алтынай Танибергеновна Бакиева Флюра Альбертовна Саримбекова Сауле Нургалиевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Хорьков И.А. Дезинтеграция бруцелл ультразвуком при промышленном производстве диагностикумов. Москва, 1978, с.174-175(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ИЗ БРУЦЕЛЛ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к получению биологических препаратов и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов,не обладающих,сенсибилизирующими свойствами и может найти широкое применение в ветеринарной практике для диагностики бруцеллеза. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается повышением Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению биологических препаратов и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов,не обладающих,сенсибилизирующими свойствами и может найти широкое применение в ветеринарной практике для диагностики бруцеллеза. Известен способ изготовления аллергена из бруцелл, включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием Хорьков И.А. Дезинтеграция бруцелл ультразвуком при промышленном производстве диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Москва, 1978, с.174-175. Недостатками этого способа является относительно малый выход активных начал,длительность и сложность процесса приготовления. Задачей изобретения является создание способа изготовления аллергена из бруцелл для выявления бруцеллеза с/х животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается повышением чувствительности и специфичност аллергена,получаемого из бруцелл. Способ изготовления аллергена из бруцелл,включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием, готовят взвеси бруцелл 50,0100,0 млрд концентрации из штаммов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270 на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 215 минут без охлаждения,после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт. Для изготовления аллергена из бруцелл для диагностики бруцеллеза с/х животных используют штаммы-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270, которые хранится в коллекции Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Штаммы характеризуются следующими признаками. Происхождение штаммов бактерий. Штамм-1-0268. Штамм бактерий родавыделен Эльбергем и Фенсом из организма производителя в 1953 году,путем высева из патологического материала на 2 питательную среду - Альбими с добавлением в нее стрептомицина. Идентифицирован по определителю бактерий,2005,, .370-386. Назначение штамма бактерий. Штамм предназначен для приготовления вакцины и диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Агар Д, эритрит агар, среда Альбими. Т 37-38 С,среда Белабаба. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, Т 37-38 С, в течение 48 часов в термостате. Микроккоки, длиной 0,4- 2,2 мкм, шириной 0,4 0,6 мкм, неподвижные, очертания концов округлые,по Граму не окрашиваются, (имеет красный цвет) окрашиваются по методу Козловского, не кислотоустойчивы, тип размножения деление. Размер двух-терх-суточных колоний 1,0-2,0 мм,круглые, плотные, гладкие, прозрачные и телесные в отражением света. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма условный аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразит, фагом Тб не лизируется. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы- цистеин, цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, уреаза,оксидаза, не образует сероводорода и индола, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Растет на эритритагаре, среде Альбими, Белобаба находится стабильный -форме, в -форму при выращивание на других не растут на добавлением стрептомицина,не выделяет сероводород, обладает каталазной и оксидазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Штамм-1 В-0268 хранят на твердой питательной среде в сухом виде соответственном в пробирках или запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Штамм 19 В-0269. Штамм бактерий получен абортированного плода БЭК-ом в 1923 году. Идентифицирован по определителю бактерий Назначение штамма бактерий. Штамм вакцинный для приготовления профилактических диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Эритрит агар, Бактериологический анар, среда Беллебаба, гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид, агар-агар. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, То 37-38 С, в течение 48 часов. Овоиды,длиной микроккоки размером 0,4-2,2 мм, 0,4-0,6 мкм, неподвижные, очертания концов округлые, по Граму не окрашиваются,окрашиваются по методу Козловского, не кислотоустойчивы, тип размножения деление. Размер колоний 2,0-5,0 мм, круглые, гладкие,холмиком, края ровные, с обратной стороны в проходящем свете янтарные, прозрачные -форма,колоний плотные, гладкие. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком, рН-6,8-7,2. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразит. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин, цестеин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, оксидаза,умеренно образует сероводород и индол, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Не растет на средах с содержанием пенициллина, штамм находится в стабильной -форме, умеренно обладает каталазной и уреазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Вакцинный штамм 19 В-0269 хранят в сухом виде в запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Штамм 61 В 0270. Штамм бактерий получен в 1957 году, в лаборатории Вейбридж(Англия). Идентифицирован по определителю бактерий,2005,, .370-386. Назначение штамма бактерий. Вакцинный штамм предназначен для приготовления диагностических профилактических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Агар Д, эритрит-агар с добавками, МППГГА. Т 3738 С. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, То 37-38 С, в течение 48 часов. Коккобактерии, палочковидной формы, длиной 0,6-3,0 мкм, шириной 0,4-0,8 мкм, неподвижные,очертания концов округлые, по Граму не окрашиваются,окрашиваются по методу Козловского,не кислотоустойчивы,тип размножения деление. Размер колоний 3-5 мм, круглые, выпуклые,гладкие с цельным краем, консистенсия плотные,гладкие, поверхность блестящая, -форма, с обратной стороны в проходящем свете янтарные,прозрачные. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком, рН-6,2-6,5. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм. Источники углерода глюкоза,глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, оксидаза,уреаза, образует сероводород, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Не растет на средах с пенициллином, обладает каталазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Вакцинный штамм 61 В 0270 хранят в сухом виде в запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Способ изготовления аллергена из бруцелл осуществляется следующим образом. Пример 1. Способ изготовления аллергена из культуры бруцелл готовят из штаммов-1 В-0268,19 -0269 и 61 В 0270, выращивают на эритритагаре, смывают с питательной среды стерильным физиологическим раствором, отмывают им от остатков питательных среды. Затем готовят взвеси бруцелл 50,0-100,0 млрд концентрации из штаммов,на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения, после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт. Установлено, что у полученных описанным способом препаратов сохраняется способность вызывать аллергическую реакцию организма животных зараженных всеми видами бруцелл. Срок годности готового препарата не менее 18 месяцев. Активность и специфичность полученного описанным способом аллергена была проверена в лабораторных и производственных условиях. Полученные при этом данные указывают на высокую активность и специфичность препарата,что позволяет дополнительно выявлять до 10 больных животных. Пример 2. При изучении сенсибилизирующих и антигенных свойств полиштаммного аллергена берут 20 здоровых морских свинкам и вводят аллерген в дозе 0,5 см 3 подкожно в область средней трети брюшка. Далее указанным животным было проведено 5 кратное введение аллергена внутрикожно с интервалом 2-3 дней. Через 10 и 15 дней после введения берут кровь для серологических исследований. Учет аллергических и серологических реакций производят в РБП, РСК. При этом во всех случаях был получен отрицательный результат. При исследовании сыворотки крови с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами также получены отрицательные результаты. Таким образом, аллерген из бруцелл видов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270, при 5-ти кратном введении морским свинкам в дозе 0,5 см 3 не проявляет сенсибилизирущих свойств. Эти же свойства изучали в благополучной по бруцеллезу отаре овец ТОО Байсерке-Агро. При этом 342 здоровым овцам 4-кратно с интервалом 114 дней вводят подкожно аллерген в рабочем разведении в дозе 0,5 см 3 нижнее веко левого глаза(пальперальная проба). Учет реакции производят через 48 часов. Все животные реагировали отрицательно. Через 2,5 месяца после начала опыта у данных животных была взята кровь для серологических исследований с коммерческими бруцеллезными антигенами. Были получены отрицательные результаты. Следовательно,полиштаммный аллерген бруцелл трех видов не проявляет сенсибилирующих и антигенных свойств при двух кратном введении морских свинок и при 4-кратном введении овцам в дозе 0,5 мл в пальпебральной пробе. Специфичность препарата проверяли в сравнении с контрольным коммерческим аллергеном в 2 опытах на искусственно сенсибилизированных бруцеллами видов-1 В-0268,19 -0269 и 61 В 0270, овцах. Аллергены применяли в пальпебральной пробе в дозе 0,5 мл. Реакции учитывают через 48 часов. В таблице 1 приведены результаты проверки специфичности препарата. Как видно из данных таблицы 1, полиштаммный аллерген из бруцелл трех видов проявляет более высокую активность,чем общепринятый(коммерческий) аллерген, изготовленный из бруцелл вида , применяемый для диагностики бруцеллеза овец. Так же было проведено комплексное исследование на бруцеллез в двух неблагополучных по бруцеллезу отарах овец. Всего проведено комплексное (серологическое и аллергическое) исследование на бруцеллез более 4 тысяч овец разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально утвержденные РБП и реакция РСК с коммерческими бруцеллезными антигенами. При аллергическом исследовании использовали полиштаммный аллерген из бруцелл 3-х классических видов,изготовленный путем дезинтеграции микробных клеток ультразвуком. В качестве контрольного аллергена был введен коммерческий бруцеллин. Оба аллергена вводили под кожу нижнего века левого (коммерческий бруцеллин) и правого(пальпебральная проба). Использования аллергена, изготовленного из трех штаммов бруцелл позволяет выявить в неблагополучных отарах дополнительно к общепринятому серологическому (РСК) методу 15 животных,инфицированных возбудителем бруцеллеза. Таблица 1 Сравнительная специфичность бруцеллина Номер опыта 1 2 3 Реагировало не испытуемый 10 2 10 3 10 2 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления аллергена из бруцелл,включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием, отличающийся тем, что готовят взвеси бруцелл 50,0-100,0 млрд концентрации из штаммов 61 В-0270 на триссолянокислом буфернофизиологическом растворе с рН 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения,после чего рН дезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводят рН до 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт.