Штамм целлюлолитических бактерий cellulomonas biazotea 150, используемый для получения бактериального удобрения под люцерну

(51) 01 63/00 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 05 11/08 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ростостимулирующее влияние связано с тем, что заявляемый штамм С.ИМиВ-43 штамм продуцирует биологически активные вещества витамины группы В и аминокислоты, которые оказывают стимулирующий эффект на дальнейший рост и развитие растений. Также штамм,характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам, взывающим корневые гнили, возбудителями которых являются грибы родов ризоктония,фузариум и другие. Применение штамма целлюлолитических бактерий С.ИМиВ-43 для предпосевной обработки семян люцерны приводит к повышению урожая зеленой массы в среднем на 4,8 т/га по сравнению с контролем. Штамм С.ИМиВ 43 не токсичен, не патогенен и не фитотоксичен, его использование экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы,которые участвую в процессе почвообразовании. Применение штамма в качестве бактериального удобрения дает возможность избежать применения химических удобрений и стимуляторов роста растений,нарушающих систему почва-растение-потребитель и ухудшающих качество продуктов питания.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Смирнова Ирина Эльевна(56) Инновационный патент РК 24974, 01 63/00, 12 1/20, 2012(54) ШТАММ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ 150,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД ЛЮЦЕРНУ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным удобрениям растений, и может быть использовано для повышения всхожести семян, стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений. Получен штамм целлюлолитических бактерийИМиВ-43 для использования в качестве бактериального удобрения под люцерну,отличающийся тем, что обладает способностью эффективно повышать всхожесть семян,стимулировать рост и развитие растений, и защищать растения от фитопатогенных грибов,вызывающих корневые гнили. Способность штамма С.ИМиВ-43 повышать всхожесть семян, обусловлена синтезом ферментов целлюлаз,которые частично деградируют твердую оболочку люцерны и, тем самым, ускоряются доступ воды и растворенных в ней минеральных и питательных веществ к эндосперму зародыша семени. Эффективное Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к бактериальным удобрениям растений, и может быть использовано для повышения всхожести семян, стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений. Известен штамм бактерий штамм, используемый для получения бактериального удобрения под томаты и огурцы (Патент РФ 2458119, 12 1/20 05 11/08, 2012). Недостатком является то, что штамм используют для стимуляции роста и развития томатов и огурцов и он не пригоден для других сельскохозяйственных культур. Известен штамм бактерий 5, используемый для получения удобрения для зерновых и кормовых культур(Патент РФ 2464308, 12 1/20 05 11/08,2012 г.). Недостатком является то, что штамм используется для зерновых и кормовых культур и не пригоден для люцерны. Кроме того, данный штамм не обладает антагонистическим действием по отношению к патогенным микроорганизмам,вызывающим болезни растений. Наиболее близким прототипом является ассоциация бактерийВКПМ В-4441 иВКПМ В-4465 для симуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов. (Инновационный патент РК 24974, 01 63/00 С 12 1/20 С 12 139,2012). Недостатком является то, что бактериальная ассоциация не повышает всхожесть семян люцерны и не обладает ростостимулирующей активностью. Также, данная ассоциация штаммов характеризуется не высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам растений. Задачей изобретения является получение нового штамма для бактериального удобрения растений,обладающего способностью повышать всхожесть семян, стимулировать рост и защищать растения люцерны от фитопатогенных грибов, вызывающих корневые гнили. Получен штамм целлюлолитических бактерийИМиВ-43, эффективно повышающий всхожесть семян люцерны за счет синтеза ферментов - целлюлаз и биологически активных веществ, таких как витамины группы В и аминокислоты. Штамм целлюлолитических бактерий ИМиВ-43,характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам, взывающим ризоктониоз и фузариозы корней растений. Заявляемый штамм выделен из разлагающейся древесины с последующей селекцией активного варианта на жидких и твердых средах Гетчинсона,агаризованном отваре соломы (соломенный агар). Культуру выращивают и хранят на косяках с соломенной средой следующего состава К 2 НРО 41,0 СаС 2-0,1 4-0,3 3-2,5 -0,1 3-0,01 пшеничная солома-20 дрож. экстракт 1,0, агар-7, вода водопр.-1 л. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона (г) К 2 НРО 4-1,0 СаС-0,1 О 4-0,3 3-2,5 0,1 3-0,01 глюкоза-10 дрож. экстракт-1,0 вода водопр.-1 л. Температура 28-30 С. Штамм депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ-43. Копия справки о депонировании прилагается. Характеристика штаммаИМиВ-43 ШтаммИМиВ-43,характеризуется следующими культуральноморфологическими и биохимическими признаками. Мелкие подвижные палочки 0,80,5 мкм, 1-6 полярных жгутика,грампо-ложительные,неспороносные. На плотных средах (МПА, среда Гетчинсона, соломенный агар) колонии яркожелтого цвета, гладкие, блестящие, выпуклые, с хорошим ростом, субстрат не окрашивается. Факультативный анаэроб. Растет в широких пределах значений рН от 3,5 до 8,5 (оптимум рН 6,0). Температурный диапазон роста 12-45 С(оптимум 28-30 С). Рост на синтетических средах хороший. Рост на МПБ - помутнение среды умеренное,однородное, пленка кольцеобразная, тонкая, рыхлая,гладкая, осадок обильный, рыхлый. Рост на МПА колонии круглые с ровным краем,2-4 мм в диаметре, гладкие, блестящие,пастообразной консистенции, ярко-желтого цвета. Способность к эмульгированию - равномерная суспензия в воде. Физиолого-биохимические признаки Использует следующие углеводы арабинозу,глюкозу, декстрозу, мальтозу, галактозу, ксилозу лактозу, фруктозу с образованием кислот, маннит,сахарозу с подщелачиванием среды. Энергично разлагает целлюлозу. Крахмал гидролизует, аммиак, индол и сероводород образует. Желатину разжижает, молоко подкисляет. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу. Растет на синтетической среде, используя в качестве источника азота минеральные соли, не требует внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Штамм синтезирует целлюлолитические ферменты эндо-1,4 глюканазу-4-6 ед/г, целлобиазу 31-33 ед/г. Активность целлюлаз бактерий определяют по образованию редуцирующих Сахаров при действии ферментов на целлюлозосодержащие субстраты модифицированным методом Шомоди-Нельсона(Клесов и др., 1980). Культуру выращивают и хранят на косяках с 0,7 соломенного агара. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона (г) К 2 НРО 4 - 1,0 СаС 20,1, 4 -0,3, 3- 2,5,- 0,1, 3 -0,01,глюкоза - 10, дрож. экстракт - 1,0, вода водопр. - 1 л. Температура 28-30 С, время культивирования 48 ч. Заявляемый штамм не токсичен и не патогенен для человека и животных и не обладает фитотоксичностью (не подавляет всхожесть семян,не ингибирует развитие корней, плодов и зеленой массы растений). Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером. Пример 1. ШтаммИМиВ 43 выращивают на среде Гетчинсона (состав среды приведен выше) с пшеничной соломой в качестве источника целлюлозы на качалке при 28-30 С и 180200 об/мин до концентрации 1106-1108 кл/мл. Семена люцерны перед посевом обрабатывают суспензией целлюлолитических бактерий в концентрации 1106 клеток на 1 г семян в течение 68 ч при температуре 20-25 С. Обработанные семена высевают в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания. В контроле семена замачивают в водопроводной воде. Затем раскладывают на чашки Петри с агаризованной средой Ковровцева и оставляют для проращивания при комнатной температуре. Через 7 суток проводят подсчет проростков растений,измерение надземной части и корней. Установлено,что всхожесть семян люцерны возросла по сравнению с контролем. В варианте со штаммом С.ИМиВ-43 всхожесть семян составляла 73,9, в контроле - 52,4. Длина стебля проростков обработанных семян также превышала длину проростков контроля на 38,0, корней - на 71,4(табл. 1). Разница между результатами опыта и контролем достоверна с вероятностью р 0,05. Положительное влияние обработки семян штаммом С.ИМиВ-43 обусловлено способностью штамма синтезировать ферменты целлюлазы, которые частично деградируют твердую оболочку люцерны и, тем самым, ускоряются доступ воды и растворенных в ней минеральных и питательных веществ к эндосперму зародыша семени. Также, преимуществом данного штамма является то, что штамм способен синтезировать биологически активные вещества, такие как витамины группы В (тиамин, пиридоксин,пантотеновая и никотиновая кислота) и аминокислоты, которые оказывают дополнительный стимулирующий эффект на рост и развитие проростков (табл. 2 и 3). Пример 2. Антагонистическую активность штамма С.ИМиВ-43 определяют по зонам угнетения роста фитопатогенных грибов. Тесткультуры фитопатогенных микроорганизмов засевают глубинным способом на среду Ча-пека-7 для грибов, охлажденной до 38-40 С и разливают в чашки Петри. После застывания агара из среды вырезают блоки. В полученные лунки заливают суспензию клеток с концентрацией 1106 кл/мл из расчета 0,2 мл в каждую лунку. Чашки инкубируют при температуре 28-30 С в термостате в течение шести и более суток. Учет результатов проводят по величине зон подавления роста тест-культур. Полученные данные свидетельствуют о высокой антагонистической активности штамма С.ИМиВ-43 в отношении большого ряда фитопатогенных грибов, . ,,-, .,., ,вызывающих альтернариоз, гельминтоспориоз,ризоктониоз и фузариозы сельскохозяйственных растений (табл. 4). Пример 3. Семена люцерны перед посевом обрабатывают суспензией целлюлолитических бактерий С.ИМиВ-43 из расчета 15-20 мл препарата (титр 1105-1106 кл/мл) на 1 кг семян. Обработанные семена высевают в полевых условиях порционной сеялкой СК-2 в почву, в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания. Норма высева семян 12-13 кг/га, глубина - 4-5 см. Контролем служат необработанные семена (табл. 6). Полевые опыты показывают, что обработка семян штаммом С.ИМиВ-43 увеличивает густоту всходов,кустистость растений и положительно влияет на показатели структуры урожая люцерны. Количество всходов в варианте,где семена обработывают штаммом С.ИМиВ-43, составляет в среднем 154 шт./м 2, в контроле только - 79 шт./м 2, растения имеют большую высоту растений, которая составляет 68 см, в контроле - 44 см. Установлено, что вес зеленой массы люцерны с 1 га посевной площади в варианте со штаммом С.ИМиВ-43 значительно взрастет и составляет 11,9 т/га, что на 4,8 т/га больше по сравнению с контролем. Отмечено значительное снижение пораженноти растений корневыми гнилями. Так, если в контроле поражено 25,8 растений, то при обработке штаммом С.ИМиВ-43 - только 11,2 растений. Таким образом,получен штамм целлюлолитических бактерий С.150,который можно использовать в качестве бактериального удобрения,ИМиВ-43,характеризующийся способностью активно повышать всхожесть люцерны, стимулировать дальнейший рост и развитие ее проростков. Также штамм можно применять для защиты растений люцерны от фитопатогенных грибов, вызывающих корневые гнили. Использование штамма целлюлолитических бактерий С.ИМиВ-43 для предпосевной обработки семян люцерны приводит к повышению урожая зеленой массы люцерны в среднем на 4,8 т/га по сравнению с контролем. Штамм С.ИМиВ-43 не токсичен, не патогенен и не фитотоксичен, его использование экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы,которые участвую в процессе почвообразовании. Применение штамма в качестве бактериального удобрения дает возможность избежать применения химических удобрений и стимуляторов растений. 3 Производство биомассы целлюлолитических бактерий для практического применения может быть налажено на основе простых сред, содержащих в качестве источника углерода пшеничную солому,и не требует использования факторов роста. Таблица 1 Варианты опыта Контроль Обработка штамм С.ИМиВ-43 Средняя длина стебля, см Средняя длина корня,см 3,40,1 2,10,2 4,70,2 3,60,2 Таблица 2 Синтез витаминов группы В целлюлолитическими бактериями С.ИМиВ-43 Витамины Тиамин (В 1) Пантотеновая кислота (В 3) Никотиновая кислота (Рр) Пиридоксин (В 6) Стимулирующее влияние целлюлолитических бактерий С.ИМиВ-43 на всхожесть семян и развитие проростков люцерны Таблица 3 Аминокислоты Аспарагиновая кислота Треонин Серии Глутаминовая кислота Глицин Алании В алии Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистидин Источники углерода Пшеничная солома 160,43,2 153,82,4 187,42,8 245,43,3 90,91,8 153,12,8 198,42,7 176,32,0 201,02,7 353,32,5 246,22,4 Накопление свободных аминокислот целлюлолитическими бактериями С.ИМиВ-43 на среде с различными источниками углерода, мг/1000 мл Таблица 4 Тест культуры Зоны подавления роста тест-культур, мм Прототип Штамм С.ИМиВ-43 512,2 543,0 421,2 442,5 502,0 513,2 170,6 200,6 321,4 331,1 200,7 21 0,4 432,6 452,1 291,5 301,1 261,4 321,3 382,6 401,2 402,4 44 Зоны подавления роста тест-культур, мм Прототип Штамм С.ИМиВ-43 381,0 412,4 441,0 Спектр антагонистической активности штамма С.ИМиВ-43 в отношении фитопатогенных грибов Таблица 5 Варианты опыта Влияние обработки семян штаммом С.ИМиВ-43 на их всхожесть, пораженность проростков и урожайность люцерны. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм целлюлолитических бактерий 150, депонированный в Институте микробиологии и вирусологии, под номером ИмиВ-43, используемый для получения бактериального удобрения под люцерну.