Способ диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста

(51) 01 33/48 (2006.01) 12 15/10 (2006.01) 12 1/02 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ генетические исследования отделяемого влагалища на наличие ДНК жизнеспособных бактерий ., . , М. , С. ,. с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, и при определении обсемененности по росту колоний условнопатогенных микроорганизмов в количестве более 103 КОЕ/мл, а также при определении наличия ДНК жизнеспособных возбудителей . , ., М. , С. , С.диагностируют бактериальный вагиноз, вызванный бактериями . , . , М. ,С. , С. . Используемая для диагностики полимеразноцепная реакция в реальном времени, основанная на анализе нуклеотидной последовательности,позволяет определять геном жизнеспособного микроорганизма, является чувствительной (94100) и специфичной (97-100). Изобретение позволяет диагностировать в 96 случаев репродуктивно значимых инфекций у женщин. Разработанный способ является эффективным для выявления активности воспаления при бактериальном вагинозе, позволяет осуществить выбор тактики лечения и назначения определенных доз лечебных препаратов.(72) Орадова Аксолтан Шыхдурдыевна Каракушикова Айгуль Садвакасовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный медицинский университет им. С.Д.Асфендиярова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической и лабораторной диагностике. Способ диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста включает взятие отделяемого влагалища, проведение диагностики отделяемого влагалища на бактериальное обсеменение, при этом дополнительно определяют степень микробной обсемененности путем посева отделяемого влагалища на соответствующие среды для выращивания колоний условно- патогенных микроорганизмов, а также проводят молекулярно 26937 Изобретение относится к медицине, а именно, к гинекологии и клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста. Известен способ диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста,включающий взятие влагалищного содержимого,проведение экспресс-диагностики влагалищного содержимого с помощью аминного теста путем нанесения на предметное стекло 10 раствора гидроокиси калия,проведение измерения водородного показателя влагалищного содержимого, характеризующего его кислотность при бактериальном обсеменении, при значениявлагалищного содержимого более 4,5 и при положительном результате аминного теста диагностируют бактериальный вагиноз(Амбулаторно-поликлиническая помощь в гинекологии / Под редакцией В.А. Бенюка. - К. Издат. дом Здоровье Украины. - 2007. - с.125128). Преимуществом известного способа является экспресс-диагностика наличия бактериального вагиноза наружных половых органов женщины. Однако известный способ является недостаточно точным, а также недостатком способа является егб низкая чувствительность,ранние стадии бактериального вагиноза известный способ не диагностируют, т.к. этот показатель может быть использован для диагностики бактериального вагиноза только 3 стадии. Задачей изобретения является разработка способа диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста, который позволяет повысить эффективность диагностики,определить возбудитель инфекции, что дает возможность определить тактику и повысить эффективность терапии бактериального вагиноза. Способ диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста включает взятие отделяемого влагалища, проведение диагностики отделяемого влагалища на бактериальное обсеменение, при этом дополнительно определяют степень микробной обсемененности путем посева отделяемого влагалища на соответствующие среды для выращивания колоний условно- патогенных микроорганизмов, а также проводят молекулярногенетические исследования отделяемого влагалища на наличие ДНК жизнеспособных бактерий ., . , М. , С. ,. с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, и при определении обсемененности по росту колоний условнопатогенных микроорганизмов в количестве более 103 КОЕ/мл, а также при определении наличия ДНК жизнеспособных возбудителей . , ., М. , С. , С.диагностируют бактериальный вагиноз, вызванный бактериями . , . , М. ,С. , С. . Способ осуществляют следующим образом. Проводят оценку состояния слизистой оболочки преддверия влагалища у больных женщин с 2 бактериальным вагинозом, наружного отверстия уретры, наличия и характера вагинальных выделений пальпаторно оценивают состояние мочеиспускательного канала и парауретральных желез. При этом для определения функционального состояния репродуктивной системы необходимо проведение качественной оценки микрофлоры по морфотипам и тинкториальным свойствам,количественное определение обсемененности бактериями - согласно критериям (1991) в модификации А.С.Анкирской (2001). У пациенток отделяемое влагалища берут стерильным универсальным зондом из заднебоковых сводов влагалища при осмотре в зеркалах. Каплю отделяемого влагалища капают на предметное стекло, на которое добавляют равное количество 10 раствора гидроокиси калия. Появление или усиление резкого неприятного запаха (запаха гнилой рыбы) свидетельствует о положительных результатах аминного теста, что обусловлено выделением летучих аминов продуктов метаболизма облигатных анаэробных микроорганизмов. Положительный аминный тест один из критериев бактериального вагиноза. Затем осуществляют исследование отделяемого влагалища с помощью индикаторных бумажных полосок для рН-метрии с эталонной десятичной шкалой деления от 3.8 до 6.1 ( Германия), при значенииотделяемого влагалища более 4,5 считают этот показатель положительным и одним из критериев бактериального вагиноза. Степень микробной обсемененности определяют путем секторального посева отделяемого влагалища на 5 кровяной агар, среду Эндо, среду Сабуро или среду МРС. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при температуре 37 С в течение 18 часов. При появлении роста подсчитывают общее количество колоний и микробов каждого вида отдельно, выражая результат в степени колонизации в КОЕ/мл. Диагностическим значимым микробиологическим результатом обсемененности считают рост колоний условно-патогенных микроорганизмов в количестве более 103 КОЕ/мл. Проводят исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных бактерий ., . , М. , С. ,С. с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и при определении наличия ДНК жизнеспособных возбудителей, . , М. , С. , Метод полимеразно-цепной реакции в реальном времени основан на анализе нуклеотидной последовательности,является наиболее чувствительным (94-100) и специфичным (97100). Проведение исследований с помощью полимеразно-цепной реакции состоит из следующих этапов 1) экстракция (выделение) ДНК из исследуемых- отделяемого влагалища - образцов 2) проведение амплификации или амплификации с детекцией в режиме реального времени (вариант) 3) анализ и интерпретация результатов. Реакцию проводят в режиме реального времени,т.е. совмещают этапы амплификации и детекции продуктов амплификации. Для экстракции(выделения) ДНК используют наборы реагентов ДНК-сорб-АМ, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией к используемому набору. Экстракция ДНК из каждого отделяемого влагалища проводят в присутствии внутреннего контрольного образца. Клинический образец - отделяемое влагалища,помещенный в транспортную среду, обрабатывают лизирующим раствором в присутствии частиц силики - сорбента. В результате происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. Добавляют раствор для элюции ДНК к сорбенту,при этом происходит переход ДНК с поверхности сорбента в раствор, который отделяется от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получают высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации,что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность полимеразноцепной реакции. Примеры выполнения способа. Пример 1. Пациентка А., возраст 26 лет. Клинический диагноз бактериальный вагинозстадии. Поступила с жалобами на зуд, жжение наружных половых органов. Во время обследования было выявлено состояние слизистой оболочки преддверия влагалища удовлетворительное. Наружные половые органы без патологии вагинальный секрет водянистый, в большом количестве, белого цвета, с неприятным запахом и адгезией на стенках влагалища. Отделяемое из цервикального канала слизистое, в небольшом количестве,вагинального секрета 6,2, аминный тест положительный. При первичном микробиологическом исследовании микрофлоры влагалища у пациентки выявлен,микробиологический результат обсемененности определен рост колоний условнопатогенных микроорганизмов в количестве более 103 КОЕ/мл. Проведено исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных, . с помощью полимеразноцепной реакции в режиме реального времени. Была определена ДНК бактерий С. . Было назначено регулярный прием препарата метронидазола (Трихопол) по 500 мг 1 раз в сутки в течение 7 дней, контроль осмотра у гинеколога через 2 недели. Через 2 недели жалоб не было, состояние слизистой оболочки преддверия влагалища и наружного отверстия уретры было удовлетворительное. Гинекологический осмотр показал отсутствие патологических выделений,положительного аминного теста, вагинальных выделения - нет, что свидетельствовало о том, что активность воспаления уменьшилась,доза препарата была уменьшена до 250 мг в день. Пример 2. Пациентка Ф., возраст 34 лет. Клинический диагноз бактериальный вагинозстадии. Поступила с жалобами на сильный зуд, жжение наружных половых органов, дизурию, диспареунию,тазовые боли. Во время обследования было выявлено наружные половые органы без патологии. При осмотре в зеркалах имелось умеренное количество гомогенного серого вагинального секрета с неприятным запахом и адгезией на стенках влагалища. Отделяемое из цервикального канала слизистое, в небольшом количестве.вагинального секрета - 5,9, аминный тест положительный. При бимануальном обследовании матка и придатки не изменены. Определен рост бактериальных культур. более 106 КОЕ/мл. Остальные микроорганизмы определялись в допустимых количествах. Проведено исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных бактерий . , . , М. , С., . с помощью полимеразноцепной реакции в режиме реального времени. Была определена ДНК бактерий С.и Было назначено интравагинальное введение суппозиториев с трихополом в сочетании с нистатином 1 раз в сутки на ночь, контроль осмотра у гинеколога через 10 дней. Через 2 недели была выявлена . из патологического материала с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, что является свидетельством того, что активность воспаления сохранялась. Был назначен нистатин по 1 свече 1 раз в сутки, в течение недели. После терапии больная отметила явное улучшение состояния, в частности прекращение патологических выделений, исчезновение зуда,жжения половых органов. Гинекологический осмотр показал отсутствие патологических выделений,положительного аминного теста. При микробиологическом исследовании вагинального секрета через месяц после окончания терапии отмечено отсутствие бактериальной обсемененности Пример 3. Пациентка Б., возраст 28 лет. Клинический диагноз бактериальный вагинозстадии. Поступила с жалобами на зуд, жжение наружных половых органов. Во время обследования было выявлено наружные половые органы без патологии вагинальный секрет водянистый, в большом количестве, белого цвета, с неприятным запахом и адгезией на стенках влагалища. Отделяемое из цервикального канала слизистое, в небольшом количестве,отделяемого влагалища - 6,8,аминный тест - положительный. При микробиологическом исследовании микрофлоры влагалища у пациентки выявлено, что микроорганизмы определялись в допустимых количествах. Проведено исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных бактерий . , . , М. , С., . с помощью полимеразноцепной реакции в режиме реального времени. Была определена ДНК бактерий . . Был назначен регулярный прием препарата метронидазола (Трихопол) по 500 мг 1 раз в сутки в течение 7 дней, контроль осмотра у гинеколога через 2 недели. Через 2 недели жалоб не было, состояние слизистой оболочки преддверия влагалища и наружного отверстия уретры было удовлетворительное, вагинальных выделения - нет,что свидетельствовало о том, что активность воспаления уменьшилась, доза препарата была уменьшена до 250 мг в день. После терапии больная отметила явное улучшение состояния, в частности прекращение патологических выделений, исчезновение зуда,жжения половых органов. Гинекологический осмотр показал отсутствие патологических выделений,положительного аминного теста. При микробиологическом исследовании отделяемого влагалища отмечена нормализация через месяц после окончания терапии. Пример 4. Пациентка К., возраст 31 год. Клинический диагноз бактериальный вагинозстадии. Поступила с жалобами на сильный зуд, жжение наружных половых органов, дизурию, диспареунию,тазовые боли. Во время обследования было выявлено состояние слизистой оболочки преддверия влагалища, наружного отверстия уретры,наличия творожистого характера вагинальных выделений наличие воспалительных проявлений гиперемии, отека, наличие в заднем своде влагалища гнойного отделяемого,отделяемого влагалища - 6,8, аминный тест положительный. При микробиологическом исследовании микрофлоры влагалища у пациентки выявлен рост числа . более 107 КОЕ/мл. Остальные микроорганизмы определены в допустимых количествах. Проведено исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных 4, . с помощью полимеразноцепной реакции в режиме реального времени. Определено наличие ДНК бактерий .и Было назначено интравагинальное введение суппозиториев с трихополом в сочетании с нистатином 1 раз в сутки на ночь, контроль осмотра у гинеколога через 10 дней. Через 2 недели была выявлена ДНК . с помощью полимеразно-цепной реакции в реальном времени, что свидетельствовало об активности воспаления. Был назначен нистатин по 1 свече 1 раз в сутки, в течение недели. После проведенной терапии больная отметила явное улучшение состояния,в частности прекращение патологических выделений,исчезновение зуда, жжения половых органов. При гинекологическом осмотре определили отсутствие патологических выделений,положительного аминного теста. При микробиологическом исследовании отделяемого влагалища через месяц после окончания терапии отмечен исчезновение ДНК .и Пример 5. Пациентка М., возраст 29 лет. Клинический диагноз бактериальный вагинозстадии. Поступила с жалобами на зуд, жжение наружных половых органов. Во время обследования было выявлено состояние слизистой оболочки преддверия влагалища удовлетворительное. Наружные половые органы без патологии вагинальный секрет водянистый, в большом количестве, белого цвета, с неприятным запахом и адгезией на стенках влагалища. Отделяемое из цервикального канала слизистое,в небольшом количестве,отделяемого влагалища- 7, аминный тест положительный. При микробиологическом исследовании микрофлоры влагалища у пациентки выявлено, что рост микроорганизмов в допустимых количествах. Проведено исследование в отделяемом влагалища количества ДНК жизнеспособных бактерий . , . , М. , С., . с помощью полимеразноцепной реакции в режиме реального времени. Определено наличие ДНК бактерий М.в 109 МЕ/мл. Был назначен регулярный прием препарата метронидазола (Трихопол) по 250 мг 1 раз в сутки в течение 7 дней, контроль осмотра у гинеколога через 2 недели. Через 2 недели жалоб не было, состояние слизистой оболочки преддверия влагалища и наружного отверстия уретры было удовлетворительное, вагинальных выделения - нет,что свидетельствовало о том, что активность воспаления уменьшилась. После терапии больная отметила явное улучшение состояния, в частности прекращение патологических выделений, исчезновение зуда,жжения половых органов. При гинекологическом осмотре определили отсутствие патологических выделений, положительного аминного теста. При микробиологическом исследовании вагинального секрета через месяц после окончания терапии отмечено исчезновение М. . Апробация способа диагностики была проведена у 146 пациенток в возрасте 15-45 лет, с длительностью бактериального вагиноза от нескольких дней до 2 лет. В результате проведенного комплексного клинико-лабораторного и молекулярно генетического было обследовано 146 небеременных женщин репродуктивного возраста. Было установлено нормальное состояние микрофлоры влагалища у 50 (34,2) и бактериальный вагиноз у 96 (65,8), протекающий в ассоциации с другими патогенными и/или условно-патогенными возбудителями в 66 (68,8) случаев, в том числе с . , . ,М. , С. , Причем у 21 (21,9) пациентки отмечена ассоциация бактериального вагиноза с одним инфекционным агентом, у 23 (23,9) - двумя, у 10(10,4) - тремя у 27 (28,1) пациенток выявлена многоочаговость процесса. Используемая для диагностики полимеразноцепная реакция в реальном времени, основанная на анализе нуклеотидной последовательности,позволяет определять геном жизнеспособного микроорганизма, является чувствительной (94100) и специфичной (97-100). Изобретение позволяет диагностировать в 96 случаев репродуктивно значимых инфекций у женщин. Разработанный способ является эффективным для выявления активности воспаления при бактериальном вагинозе, позволяет осуществить выбор тактики лечения и назначения определенных доз лечебных препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста, включающий взятие отделяемого влагалища,проведение диагностики отделяемого влагалища на бактериальное обсеменение, отличающийся тем,что дополнительно определяют степень микробной обсемененности путем посева отделяемого влагалища на соответствующие среды для выращивания колоний условно-патогенных микроорганизмов, а также проводят молекулярногенетические исследования отделяемого влагалища на наличие ДНК жизнеспособных бактерий ., . , М. , С. ,С.с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, и при определении обсемененности по росту колоний условнопатогенных микроорганизмов в количестве более 103 КОЕ/мл, а также при определении наличия ДНК жизнеспособных возбудителей . , .