Способ диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе

(51) 61 33/24 (2006.01) 61 33/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ моделирование хронической интоксикации кадмием путем ежедневного перорального введения хлористого кадмия в течение 2,5 месяцев,определение адаптации клеток печени к токсическому стрессу на 1,7,14 и 21 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием, исследование субклеточных структур морфологическими,электронно-микроскопическими, биохимическими,морфометрическими и статистическими методами по сравнению с контролем, при этом, если на 21 сутки после окончания моделирования значения исследуемых параметров клеток печени, таких как цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума,митохондрии,рибосомы,прикрепленные и рибосомы полисомальные, а также содержание соответственно липидов, гликогена,билирубина, аминотрансфераз АлАТ и АсАТ приближены к таковым значениям в контроле, то диагностируют адаптацию клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе. Способ снижает травматичность выполнения моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием, повышает эффективность определения компенсаторно-адаптационных,восстановительных процессов при экспериментальном экзотоксикозе.(72) Жаксылыкова Айман Камаловна Нурмухамбетова Балумаржан Наскеновна Мустафина Альфия Рафкатовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Карапетян Г.Р. Ультраструктура митохондрий печени крыс при стрессах различной этиологии // Медицинская наука Армении, 2009, Т.49, 2,с.45-50(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АДАПТАЦИИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ К ТОКСИЧЕСКОМУ СТРЕССУ ПРИ ЭКЗОТОКСИКОЗЕ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, позволяет изучить при помощи морфологических, электронно-микроскопических,биохимических,морфометрических и статистических методов определить развитие адаптивных перестроек в клетках печени к токсическому стрессу на экспериментальной модели хронического экзотоксикоза хлористым кадмием. Способ диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе включает Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, позволяет изучить при помощи морфологических, электронно-микроскопических,биохимических, морфометрических и статистических методов развитие адаптивных перестроек в клетках печени к токсическому стрессу на экспериментальной модели хронического экзотоксикоза хлористым кадмием. Частой причиной гепатобилиарной патологии на современном этапе развития общества становится воздействие на печень токсических соединений. В окружающей среде известно более 80 тысяч гепатотоксических ксенобиотиков. Среди загрязнителей внешней среды тяжелые металлы занимают существенное положение. Кадмий занимает одно из ведущих мест по распространенности и высокой токсичности. Он обладает не только высокой токсичностью, но и высокой кумулятивной способностью. Ионы кадмия сохраняются в организме 20-30 лет и очень медленно выводятся из организма, что вызывает состояние хронического токсического стресса. Известен способ диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе,включающий моделирование хронической интоксикации хлористым кадмием путем его интраперитонеального введения,определения адаптации клеток печени к токсическому стрессу по определению ультраструктурных изменений в митохондриях клеток печени (Карапетян Г.Р. Ультраструктура митохондрий печени крыс при стрессах различной этиологии // Медицинская наука Армении.- 2009.- Т.49, 2. - с.45-50). Ультраструктура энергопродуцирующих структур в клетках печени нарушалась в виде группирования митохондрий и образования гигантских митохондрий,что объясняется повышенной потребностью в энергии. Образующиеся подобные структуры, оказывались в функционально неактивном состоянии, выпадая из энергопродуцирующей системы клеток. Недостатками известного способа является то,что моделированную хроническую интоксикацию выполняют травматично, при этом исследуют в клетках печени только митохондрии, в то время как нарушениям при токсическом стрессе подвергаются и другие структуры печеночной клетки нет морфометрической доказательной базы исследования изучаемых структур, которая дает наиболее достоверные показатели развития адаптационных процессов. Задачей изобретения является создание эффективного способа диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе,адаптивных перестроек,развивающихся в клетках печени и в их субклеточных структурах при токсическом стрессе,на экспериментальной модели хронического экзотоксикоза хлористым кадмием. морфологическими,электронномикроскопическими,биохимическими,морфометрическими и статистическими методами. Это дает возможность улучшить диагностику и 2 лечение различных токсических повреждений печени. Техническим результатом изобретения является повышение эффективности определения адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе,что выявляется морфофункциональными изменениями в клетках и субклеточных структурах печени на 1 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием, которые постепенно снижаются в последующие сроки на 7,14 и на 21 сутки после экзотоксикоза, за счет активации адаптивных реакций. Способ диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе включает моделирование хронической интоксикации кадмием путем ежедневного перорального введения хлористого кадмия в дозе 3 мг/кг массы тела в течение 2,5 месяцев, определение адаптации клеток печени к токсическому стрессу определяют на 1,7,14 и 21 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием,исследование субклеточных структур морфологическими, электронно-микроскопическими, биохимическими, морфометрическими и статистическими методами по сравнению с контролем, при этом, если на 21 сутки после окончания моделирования значения исследуемых параметров клеток печени,таких как цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, митохондрии,рибосомы прикрепленные и рибосомы полисомальные, а также содержание соответственно липидов, гликогена, билирубина, аминотрансфераз АлАТ и АсАТ приближены к таковым значениям в контроле, то диагностируют адаптацию клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе. Способ осуществляют следующим образом. Лабораторному животному (белые крысы-самцы,массой тела 180-200 г.) проводят моделирование хронического экзотоксикоза путем ежедневного перорального введения в пищевой рацион крысы хлористого кадмия в дозе 3 мг /кг массы тела, в течение 2,5 месяцев. Адаптационные изменения в клетках печени крыс и в их субклеточных структурах исследуют на 1,7,14 и 21 сутки после окончания моделирования экзотоксикоза морфологическими, электронномикроскопическими,биохимическими,морфометрическими и статистическими методами,если на 21 сутки после окончания моделирования значения исследуемых параметров клеток печени,таких как цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, митохондрии,рибосомы прикрепленные и рибосомы полисомальные, а также содержание соответственно липидов, гликогена, аминотрансфераз АлАТ и АсАТ приближены к таковым значениям в контроле, то диагностируют адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе. Пример. Предлагаемый способ был изучен в эксперименте на белых крысах - самцах, в количестве 130 штук, массой 180-200 г. в возрасте 56 месяцев. Хроническую интоксикацию хлористым кадмием моделировали путем ежедневного перорального введения в пищевой рацион крыс хлористого кадмия в дозе 3 мг/кг массы тела в течение 2,5 месяцев. Выявлены значительные морфофункциональные, адаптивные изменения,развивающиеся в клетках печени и их субклеточных структурах в процессе их компенсаторноадаптационной перестройки. Адаптационные изменения в клетках печени крыс и в их субклеточных структурах исследовались на 1,7,14 и 21 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием морфологическими, электронно-микроскопическими, биохимическими, морфометрическими и статистическими методами по сравнению с контролем, при этом исследовали такие параметры как цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума,митохондрии,рибосомы прикрепленные и рибосомы полисомальные, а также содержание соответственно липидов, гликогена,АлАТ и АсАТ. Исследования на 1 сутки после экзотоксикоза показали структурные нарушения со стороны клеток и его субклеточных структур в виде отека,вакуольной дистрофии, деструкции клеток и ядер расширения и фрагментации цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) снижения численной плотности рибосом отека, изменения формы и плотности матрикса митохондрий, их слияния с образованием гигантских митохондрий, редукции их крист расширений каналов аппарата Гольджи, возрастания плотности лизосом и пероксисом. Эти изменения явились проявлениями адаптивных перестроек печеночных клеток к токсическому стрессу. Отмечалось существенное снижение уровня гликогена и значительное возрастание липидов, что свидетельствовало об энергетическом дисбалансе в клетке. Известно, что показатели каналов ГЭР и численной плотности рибосом определяют способность клетки к одной из основных ее функций клеток - синтезу белков, а показатели митохондрий, уровня липидов и гликогена определяют энергопродуцирующую функцию клеток печени. Изменения этих показателей при электронно-микроскопическом и морфометрическом исследовании указывали на значительное адаптивное напряжении клеток печени в результате токсического стресса, созданного экзотоксикозом, (таблица 1). На 1 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием проводили также биохимические исследования крови, которые показали значительное возрастание уровня аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ) - (таблица 2) и билирубина - (таблица 3), которые свидетельствовали о функциональных изменениях в печени, вследствие адаптивного напряжения печеночных клеток к токсическому стрессу и частичной гибели клеток. Таблица 1 Адаптационные изменения в клетках печени крыс при токсическом стрессе в условиях экспериментального хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3 мг/кг м.т. (М) Исследованные Контроль 1-сутки после 7-е сутки после 14-е сутки после 21-е сутки после Параметры экзотоксикоза экзотоксикоза экзотоксикоза экзотоксикоза Митохондрии 31,41,19 49,11,14 44,10,16 39,80,09 33,30,15 ГЭР 10,60,39 22,61,18 19,21,43 15,91,43 13,10,12 Рибосомы 97,818,2 33,89,16 45,020,1 56,020,1 79,8718,8 прикрепленныеРибосомы 124,925,0 48,614,2 57,315,4 73,412,2 91,415,5 полисомальныеГликоген 10,62,18 5,02,17 5,41,16 6,10,62 8,01,17 Липиды 0,10,07 4,920,12 3,210,19 2,930,21 1,510,14 Примечание ГЭР - гранулярная эндоплазматическая сеть,- объемная плотность структур ( от объема цитоплазмы)- численная плотность структур (число в 1 мкм 3 объема цитоплазмы)- отмечены отличия, достоверные относительно соответствующих величин в контроле. Таблица 2 Изменения содержания аминотрансфераз в крови крыс, определяющих адаптацию клеток печени к токсическому стрессу, в условиях экспериментального хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3 мг/кг м.т. (М) 1-е сутки после экзтоксикоза 2 АлАТ (мккат/л) 0,140,02 0,470,03 3,0 мг/кг АсАТ (мккат/л) 0,150,02 0,610,02 Примечание -(Р 0.05) и( Р 0.01) Условия опыта 7-е сутки 14-е сутки после после экзтоксикоза экзтоксикоза 0,390,02 0,340,03 0,510,01 0,410,02 21-е сутки после экзтоксикоза 0,220,02 0,270,04 Таблица 3 Изменения содержания билирубина (ммоль/л) в плазме крови крыс, определяющих адаптацию клеток печени к токсическому стрессу, в условиях экспериментального хронического экзотоксикоза хлористым кадмием в дозе 3 мг/кг м.т. (М) 1 -е сутки после 7-е сутки после экзотоксикоза экзотоксикоза 2 3,0 мг/кг 8,100,05 25,160,05 21,740,06 Примечание -(Р 0.05) и( Р 0.01) Условия опыта Контроль Все указанное выше являлось признаками адаптивной перестройки клеток печени к токсическому стрессу. На 7, 14 и 21 сутки проводили повторные электронно-микроскопические, морфометрические и биохимические исследования, которые показали постепенное снижение степени морфофункциональных нарушений в клетках, за счет активации адаптационных процессов. К 21 суткам происходило частичное восстановление структурной организации печеночных клеток и субклеточных структур ядер,каналов ГЭР, численной плотности рибосом,структуры митохондрий, снижался дисбаланс между основными энергетическими субстратами клетки(гликогеном и липидами). Это свидетельствовало о дальнейшей активации адаптационных реакций,приводящих к снижению морфофункциональных нарушений в клетках печени (таблица 1,2,3). Надо отметить,что структурно-функциональные Примеры определена адаптация хороший результат Исследуемые Контроль 1-е сутки объекты Численная плотность 97,818,2 33,89,16 прикрепленных рибосом Численная плотность полисо 124,925,0 48,614,2 мальных рибосом(мккат/л) Уровень билиру 8,100,05 25,160,05 бина (ммоль/л)- объемная плотность структур ( от 14-е сутки после экзотоксикоза 17,230,11 21-е сутки после экзотоксикоза 13,820,06 изменения в клетках печени и на 21 сутки, в некоторой степени, еще сохранялись, что свидетельствует о длительности адаптационных,восстановительных процессов. В процессе адаптивного напряжения к токсическому стрессу, в условиях хронического экзотоксикоза хлористым кадмием, погибло - 3 крысы. В процессе экзотоксикоза на 57-е и 63 сутки погибли 2 крысы. 1 крыса погибла на 3 сутки, после окончания экзотоксикоза. Это свидетельствовало о том, что в печени крыс,находящихся в процессе адаптивного напряжения,могут происходить значительные энергетические траты, ускоренное расходование их и истощение резервных возможностей печеночных клеток, а также значительное снижение их белоксинтезирующей функции, которые приводят к формированию патологических процессов и к гибели животного. Нет адаптации - плохой результат у погибших крыс Эти данные свидетельствуют о 21-е сутки значительном ухудшении белоксинтезирующей функции 19,73,71 клеток,плохой адаптивной способности их, что привело к 79,8718,8 гибели клеток и развитию патологических процессов. Это привело к гибели крысы. 91,415,5 Эти данные свидетельствуют о существенном нарушении энергообразующей функции клеток,плохой адаптивной 33,30,15 77,13,15 способности клеток к токсическому стрессу,что способствовало развитию патологических процессов и гибели крысы. Эти данные свидетельствуют о 0,220,02 0,710,17 гибели клеток печени,вследствие плохой адаптивной 0,270,04 0,970,14 способности их, что привело к развитию патологических 13,820,06 41,710,19 процессов и гибели крысы. объема цитоплазмы)- численная плотность структур- отмечены отличия, достоверные относительно соответствующих величин в контроле(Р 0.05) и( Р 0.01). Приведенные данные свидетельствовали о том,что значительная активность адаптационнокомпенсаторных реакций в клетках печени при экзотоксикозе кадмием, способствует частичному восстановлению их структурно-функциональной организации к 21 суткам, после экзотоксикоза. В то время как, недостаточность адаптивных реакций приводило к гибели животного. Предложенный способ доказывает возможность диагностики адаптивной способности клеток печени к токсическому стрессу в условиях хронического экзотоксикоза хлористым кадмием при помощи изучения морфофункциональных изменений в клетках и их субклеточных структурах. На 21 сутки после экзотоксикоза,вследствие активации компенсаторно-адаптационных процессов,происходит частичное восстановление структуры и функции клеток. Однако, морфофункциональные изменения в клетках печени на 21 сутки, в некоторой степени, еще сохранялись, что свидетельствует о долговременности компенсаторно-адаптационных, восстановительных процессов. Указанное выше дает возможность правильного диагностирования и лечения токсических гепатитов на различных этапах развития болезни. Способ снижает травматичность выполнения моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием, повышает эффективность определения компенсаторно-адаптационных, восстановительных процессов при экспериментальном экзотоксикозе. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики адаптации клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе,включающий моделирование хронической интоксикации хлористым кадмием путем ежедневного перорального введения хлористого кадмия в течение 2,5 месяцев, определение адаптации клеток печени к токсическому стрессу на 1,7,14 и 21 сутки после окончания моделирования хронической интоксикации хлористым кадмием,исследование субклеточных структур клеток печени морфологическими, электронно-микроскопическими, биохимическими, морфометрическими и статистическими методами по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, если на 21 сутки после окончания моделирования значения исследуемых параметров клеток печени, таких как цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, митохондрии, рибосомы прикрепленные и рибосомы полисомальные, а также,содержание соответственно липидов, гликогена,билирубина, аминотрансфераз АлАТ и АсАТ приближены к таковым значениям в контроле, то диагностируют адаптацию клеток печени к токсическому стрессу при экзотоксикозе.