Способ получения бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н5 и Н7

(51) 61 39/145 (2011.01) 12 7/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Кадырбаев Жайлаубай Кыдырбаевич Табынов Кайсар Казыбаевич Кожамкулов Еркен Муратханович Рыскельдинова Шолпан Жанбырбаевна Асанжанова Нурика Нарынбековна Инкарбеков Дулат Амангелдиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Джавадов Э.Д., Амдий Э.М., Придыбайло Н.Д. и др. Испытание вакцины против высокопатогенного гриппа птиц в эксперименте // Ветеринария и санитария, 2006,3, с. 40-43(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИВАЛЕНТНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬГИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ СУБТИПОВ Н 5 И Н 7(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и представляет собой способ приготовления бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7. Предлагается способ приготовления бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 из эпизоотически актуального аутогенного штамма А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (51),выделенного в Павлодарской области в 2005 году и эталонного штамма А/цыпленок/Росток/29(Н 71). Вирусы адаптированы к куриным эмбрионам 12 суточного возраста. В качестве инактиванта используют димер этиленимина. Инактивацию вируса проводят в течение 30 часов при температуре 370,5 С. Инактивированная суспензия вируса объединяется с адъювантом Монтанид ИЗА-70 компании (Франция) в соотношении 37. Полученная вакцина представляет собой стойкую однородную эмульсию белого цвета с синим оттенком. Вакцина бивалентная инактивированная эмульгированная субтипов Н 5 и Н 7, изготовленная по предложенному способу, безвредна и формирует напряженный иммунитет против высокопатогенного гриппа птиц после однократной вакцинации домашних птиц. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Известен способ приготовления бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7, где в качестве производственных штаммов использованы вирусы с антигенными формулами 53 и 73. По данному способу производственные вирусы культивируют в 10-суточных куриных эмбрионах при температуре 370,5 С в течение 72 ч. Вирусы инактивируют бета-пропилактоном в конечной концентрации 0,1, а в качестве адъюванта используют-70 (, ) Джавадов Э.Д., Амдий Э.М., Придыбайло Н.Д. и др. Испытание вакцины против высокопатогенного гриппа птиц в эксперименте//Ветеринария и санитария. - 2006. -3. - с.40-43. При изготовлении аналога в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской Федерации в качестве инактиванта использовали бета-пропилактон. Однако в литературе хорошо известно, что колебания концентрации бетапропилактона сопровождается нежелательной реакцией с вирусными белками и вследствие этого к снижению антигенной активности. . ., 1975,357. Бетапропилактон в значительной мере изменяет структуру 7 эпитопов, эпитопы всех инактивированных антигенов отличаются сниженной способностью реагировать со специфическими моноклональными антителами в случае хранения их более 6 мес .. . ., 1991, 33, 367. Бета-пропилактон одновременно с инактивацией вируса вызывает снижение гемагглютинирующей активности Сафонов Г.А., Калинина Т.А. Ветеринария, 1987,с.36. В этой связи нами был выбран другой инактивант - димер этиленимина. По мнению Сергеева В.А. Вирусные вакцины. Киев, 1993, с. 187 повышение концентрации ДЭИ и продолжительности обработки вируса в 2-3 раза не снижало иммуногенности вирусов гриппа и в то же время повышала надежность инактивации и гарантировала получение безопасного препарата,что свидетельствует о мягком инактивирующем действии ДЭИ на вирус при полном подавлении инфекционности вируса не оказывая существенного влияния на гемагглютинирующую активность. Использование штамма А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (51), относящегося к клайду 2,2,усиливает эффективность предлагаемой вакцины, поскольку иммунитет формируется против антигенов штамма вируса, наиболее близкого к циркулирующим вирусам гриппа на территории Казахстана. В прототипе вакцины такой подход к выбору вируса отсутствует. Задача изобретения - разработка способа получения бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7. Сущность изобретения - способ приготовления бивалентной инактивированной эмульгированной 2 вакцины из штаммов А/домашний гусь/ Павлодар/1/05(51) и А/цыпленок/Росток/29/(Н 71) для специфической профилактики высокопатогенного гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7. Предлагаемый способ позволяет приготовить безвредную и иммуногенную бивалентную инактивированную вакцину против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 из эпизоотически актуального штамма А/домашний гусь/Павлодар/1/05(Н 51) вируса с инфекционной активностью не ниже 8,5 ЭИД 50/см 3 и эталонного штамма А/цыпленок/Росток/29/(Н 71) вируса с инфекционной активностью не ниже 8,5 ЭИД 50/см 3. Пример 1. Получение вирусной биомассы и инактивация вируса гриппа из штамма А/домашний гусь/Павлодар/1/05(Н 51). Для получения бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины использовали штамм А/домашний гусь/Павлодар/ 1/05(51),с биологической активностью 9,20 ЭИД 50/см 3. Матриксным вирусом заражали 12 - суточные куриные эмбрионы, полученные из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Зараженные вирусом куриные эмбрионы культивировали в течение 40 - 48 часов при температуре (360,5)С. Через 48 ч инкубирования инфицированные куриные эмбрионы помещали в холодильную камеру при температуре от 2 до 8 С и выдерживали в течение 16-24 час. После охлаждения эмбрионов ножницами убирали скорлупу в области воздушной камеры,удаляли подскорлуповую оболочку и вскрывали хорионаллантоисную оболочку в стерильных условиях, пипеткой отбирали аллантоисную жидкость (АЖ) в стерильные флаконы. Для инактивации вируса использовали димер этиленимина(ДЭИ). Вируссодержащую аллантоисную жидкость после однократного замораживания и оттаивания осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Затем в подогретую до 24 С вируссодержащую суспензию вносили ДЭИ в конечной концентрации 0,2. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при температуре реакционной среды 370,5 С в течение 30 ч. По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до 2-8 С. Проводили три последовательных пассажа инактивированной суспензии на развивающихся куринных эмбрионах (РКЭ). Инактивированную суспензию считали авирулентной,если аллантоисная жидкость после третьего пассажа не вызывали агглютинацию эритроцитов петуха в реакции РГА. Проверку авирулентности проводили на 5 гол цыплят 1-3-месячного возраста, которым вводили инактивированную суспензию внутримышечно в область груди по 2,5 см 3. Инактивированную суспензию считали авирулентной, если в течение 10 сут после введения у цыплят не отмечали клинические признаки заболевания гриппом видимых слизистых оболочек, гребня и сережек и др.), а также гибели птицы. Пример 2. Получение вирусной биомассы и инактивация вируса гриппа из штамма А/цыпленок/Росток/29/(Н 71). Для получения бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины использовали штамм А/цыпленок/Росток/29/(Н 71), с биологической активностью 9,00 ЭИД 50/см 3. Матриксным вирусом заражали 12 - суточные куриные эмбрионы,полученные из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Зараженные вирусом куриные эмбрионы культивировали в течение 30 34 часов при температуре (360,5)С. Через 34 часа инкубирования инфицированные куриные эмбрионы помещали в холодильную камеру при температуре от 2 до 8 С и выдерживали в течение 16-24 час. После охлаждения яиц ножницами убирали скорлупу в области воздушной камеры, удаляли подскорлуповую оболочку и вскрывали хориоаллантоисную оболочку в стерильных условиях, пипеткой отбирали аллантоисную жидкость (АЖ) в стерильные флаконы. Для инактивации вируса используют ДЭИ. Вируссодержащую аллантоисную жидкость после однократного замораживания осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Затем в подогретую до 24 С вируссодержащую суспензию вносили ДЭИ конечной концентрации в 0,1. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при температуре реакционной среды 370,5 С в течение 30 ч. По окончании инактивации антигенный материал охлаждали до 2-8 С. Проводили три последовательных пассажа инактивированной суспензии на развивающихся куринных эмбрионах (РКЭ). Инактивированную суспензию считали авирулентной,если аллантоисная жидкость после третьего пассажа не вызывала агглютинацию эритроцитов петуха в реакции РГА. Проверку авирулентности проводили на 5 гол цыплятах 1-3-месячного возраста, которым вводили инактивированную суспензию внутримышечно в область груди по 2,5 см 3. Инактивированную суспензию считали авирулентной, если в течение 10 сут после введения у цыплят не отмечали клинические признаки заболевания гриппом(депрессия, потеря чувствительности, синюшность видимых слизистых оболочек, гребня и сережек и др.), а также гибели птицы. Пример 3. Составление бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины из субтипов Н 5 и Н 7 и контроль качества. После проверки стерильности и авирулентности антигенов вирусов, полученные по примеру 1 и 2 объединяли в равном объемном соотношении. Охлажденные антигены объединяли,при постоянном перемешивании добавляли масляный адъювант 37 согласно рекомендации производителя. В качестве масляного адъюванта(Сеппик). Масляный адъювант для изготовления вакцин стерилизовали согласно наставлению, прилагаемому производителем. Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивали на гомогенизаторе в течение 10-15 мин при скорости 3000 об/мин и температуре 10-15 С. При этом получали однородную эмульсию белого цвета типа вода-масло. Расфасовку инактивированной бивалентной вакцины проводили в ампулы объемом 25 см/мл) или флаконы объемом 250 см/мл). Проверку стерильности приготовленной бивалентной вакцины проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88) Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности. Заключение о стерильности вакцины давали при отсутствии роста микрофлоры в питательных средах МПА, МПБ,Сабуро, Эдварда. Стабильность эмульсии приготовленной вакцины контролировали при помощи экспресс метода - центрифугирования. Из трех флаконов с вакциной, после интенсивного встряхивания, отбирали по 12 см 3 эмульсии и переносили ее в три стеклянные центрифужные пробирки. Пробирки с эмульсией центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин, после чего измеряли линейкой высоту столба прозрачной фракции в верхней части пробирки. Эмульсию считали стабильной, если после центрифугирования в каждой из трех пробирок в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого или, если высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части пробирки, не превышала 30 мм. Разработанная бивалентная инактивированная эмульгированная вакцина против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 представляла собой стойкую однородную эмульсию, белого цвета с синим оттенком. Пример 4. Проверка безвредности бивалентной вакцины. Проверку безвредности вакцины проводили на цыплятах 1-3- месячного возраста, доставленных из хозяйств, благополучных по острым инфекционным заболеваниям и серонегативных к вирусу гриппа А. Птиц прививали внутримышечно в область груди пятикратно превышающей дозой вакцины в объеме 2,5 см 3. За привитыми птицами в течение 10 суток вели клиническое наблюдение. Вакцину считали безвредной, так как, все привитые птицы в течение всего срока наблюдения оставались клинически здоровыми (на месте введения препарата отсутствовали признаки воспаления). Пример 5. Исследование сроков наступления и продолжительности иммунитета бивалентной вакцины. Для определения сроков наступления и продолжительности иммунитета составленным образцом вакцины в объеме 0,5 см 3 внутримышечно 3 прививали по 20 голов 3-месячных цыплят у привитых цыплят на 14, 21, 28 и далее ежемесячно отбирали кровь и исследовали в РТГА. Титры антител определяли по уровню накопления антигемагглютининов в сыворотках крови привитых птиц с помощью реакции торможения гемагглютинации Бивалентную вакцину считали иммуногенной,если у 80 привитых птиц на 28 сут после иммунизации в сыворотках крови обнаруживали антитела к вирусу гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 в титрах 1 16 и выше в РТГА. Результаты исследований приведены в таблице 1. Таблица 1 Динамика образования антител и продолжительности иммунитета до 6 месяцев у цыплят, привитых бивалентной вакциной против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 в РТГА. Наименование вакцины Средние титры антител к ВГП субтипов Н 5/Н 7 в РТГА, сут 14 21 28 60 90 120 150 180 Бивалентная вакцина субтипов Н 5 1160/ 1250/ 1280/ 1145/ 190/ 156/ 126/ 126/ и Н 7 1160 1212 1250 1180 1120 184 142 142 Кол-во иммунных птиц,50/50 100/100 100/100 100/100 100/100 90/90 80/80 80/80 Данные таблицы 1 показывают, что бивалентная вакцина уже на 14 сутки после вакцинации способствует формированию антигемагглютининов к обоим субтипам вируса гриппа птиц. На 21 сутки количество иммунных птиц к субтипам Н 5 и Н 7 достигло 100 и сохранялось на этом же уровне до 60 суток после вакцинации, при этом количество иммунных птиц на протяжении 180 сут (срок наблюдения) после вакцинации сохранялось на уровне 80. У цыплят, привитых внутримышечно в дозе 0,5 см 3 бивалентной вакциной, иммунитет к вирусу гриппа субтипа Н 5 и Н 7 формируется на 14 сут после однократной иммунизации и сохраняется в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Обобщая все вышеизложенные экспериментальные данные можно заключить,впервые в Казахстане разработана технология изготовления бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7, позволяющая стабильно получать безвредный и высоко иммуногенный препарат,способный одновременно вакцинировать птиц против двух наиболее опасных субтипов вируса гриппа птиц на длительный срок. Разработанная бивалентная инактивированная эмульгированная вакцина против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 представляет собой стойкую однородную эмульсию, белого цвета с синим оттенком. Наличие взвеси вирионов в достаточно высокой концентрации,структурноморфологическая характеристика препарата подтверждены с помощью электронной микроскопии. Изобретение выполнимо в условиях научнопроизводственных центров при наличии штаммов А/домашний гусь/Павлодар/1/05(51) и А/цыпленок/Росток/29/(Н 71) вируса гриппа птиц,соответствующего технологического оборудования и соблюдения предлагаемого режима приготовления вакцины. Вакцина безвредна для птиц, внутримышечное введение ее цыплятам 60 суточного возраста в объеме 1,5 мл (трехкратная доза) не вызывает изменение физиологического состояния у привитых птиц. Разработанная вакцина на 21 сут после однократного применения формирует напряженный иммунитет у 80-100 привитых домашних птиц к субтипам Н 5 и Н 7 вируса гриппа, что в 2 раза превышает аналогичные показатели прототипов,изготовленных в России Э.Д. Джавадов, Н.Д. Придыбайло, Э.М. Амдий и др. Экспериментальные исследования инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц подтипов Н 5 и Н 7 Ветеринария в птицеводстве. -2006.-3.-с.38-42. Вакцина, разработанная по предлагаемому способу,обеспечивает иммунитет с продолжительностью 6 мес. после однократной вакцинации и 12 мес. после двукратной иммунизации, что также превышает аналогичный показатель прототипов. При этом среднегеометрические титры антител в сыворотках крови к вирусу гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 составляли 12912,2 и 11313,3 соответственно. В 2008 г. на основании Приказа директора Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности КН МОН РК 30 от 08.07.2008 г. разработанная бивалентная инактивированная эмульгированная вакцина против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 с положительными результатами прошла внутриинститутские комиссионные испытания технологии изготовления,физических и биологических характеристик. В результате комиссионной проверки установлено,что технология изготовления бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7 соответствует представленной нормативно-технической документации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бивалентной инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц субтипов Н 5 и Н 7, включающий культивирование вирусов в куриных эмбрионах 12 суточного возраста, их инактивацию димером этиленимина и эмульгирование с масляным адъювантом Монтанид ИЗА-70 (Сеппик), отличающийся тем, что используют эпизоотически актуальный производственный штамм А/домашний гусь/Павлодар/1/05(Н 51) и штамм А/цыпленок/Росток/29 (Н 71),вирус инактивирую димером этиленимина в 0,2 конечной концентрации.