Иммуноферментная тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

(51) 61 10/00 (2010.01) 61 39/21 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ предназначенных для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале против положительной сыворотки к полипептидным антигенам вирусу лейкоза. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении гипериммунной сыворотки кролика к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Иммуноферментня тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащая иммуносорбент, иммуноферментный конъюгат из иммуноглобулинов крупного рогатого скота,бикарбонатный буфер и хромоген, в качестве специфического реагента она содержит антивидовой иммунопероксидазный конъюгат с рабочим титром 1500, полученный из антител, выделенных из специфической сыворотки кроликов.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Бахтахунов Юлдаш Хевизович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТСИСТЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к лабораторной диагностике лейкоза крупного рогатого скота, а именно к способам разработки эффективных методов, 25847 Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к лабораторной диагностике лейкоза крупного рогатого скота, а именно к способам разработки эффективных методов,предназначенных для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале против положительной сыворотки к полипептидным антигенам вирусу лейкоза. Известна иммуноферментная тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота содержащая иммуносорбент, иммуноферментный конъюгат из иммуноглобулинов крупного рогатого скота, бикарбонатный буфер и хромоген ТОО Бицентр Украина. СТ ТОО 40244539-004-200815 с. Однако известный способ пригоден для выявления антител против антигенов возбудителя болезни лейкоза крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного конъюгата,полученный из иммуноглобулина крупного рогатого скота. Задачей изобретения является приготовление высокочувствительной, специфичной антителной иммуноферментной тест-системы для выявления инфицированных вирусом лейкоза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении гипериммунной сыворотки кролика к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Иммуноферментная тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота содержащая иммуносорбент, иммуноферментный конъюгат из иммуноглобулинов крупного рогатого скота, бикарбонатный буфер и хромоген, в качестве специфического реагента она содержит антивидовой иммунопероксидазный конъюгат с рабочим титром 1500, полученный из антител, выделенных из специфической сыворотки кроликов. Для приготовления вирусного антигена используют штамм вируса лейкоза крупного рогатого скота - - 0164 КазНИВИ 04/07,который хранится в коллекции Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный иститут (КазНИВИ). Штамм вируса лейкоза крупного рогатого скота - -0164(КазНИВИ) 04/07 Штамм получен из перевиваемой линии клеток почки эмбриона овцы (РЬК),адаптированной к лабораторным условиям культивирования путем множественных последовательных пассажей, а также селекции клонов вируса и репродукции в приведенной культуре клеток. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм--0164 (КазНИВИ) 04/07 вируса лейкоза крупного рогатого скота является этиологическим агентом болезни лейкоза крупного рогатого скота. Вирус культивируется в лейкоцитах больного лейкозом крупного рогатого скота и в различных линиях перевиваемых клеток. Наибольшее распространение в мире получила 2 перевиваемая линия клеток- . В культивирование его вирус активно размножается и хорошо накапливается. Эта линия используются для биохимических, морфологических и серологических исследований. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток почки эмбрионов овцыиспользуют ростовую среду,содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 телячье эмбрионалной сыворотки. Культивирование фибробластов и вируса в них осуществляют при температуре 37-38 . Морфологические признаки. Вирус лейкоза крупного рогатого скота ВЛКРС,относится к семейству ,подсемейства(онкорновирусы),который имеет род онкавирусы типа С. Все представители онкавирусов опухолеродны, имеют наружную липидсодержашую мембрану,существуют в геноме клетки хозяина в форме ДНКпровируса и распространяется вертикально не инфекционным, а генетическим путем подобно обычным клеточным генам. Вирионы типа С(диаметр около 100 нм) имеют сферическую форму,крупную (74-80 нм) центрально расположенную сердцевину. Культуральные свойства штамм - 0164 (КазНИВИ) 04/07 вируса лейкоза крупного рогатого скота репродуцируется и накапливается в перевиваемой вируспродуцирующей культуре почек эмбриона овцы , свободных от патогенных микроорганизмов в титре 18-132.и выше в РИД. В указанных титрах штамм - - 0164(КазНИВИ) 04/07 в фибробластах накапливается после 2-3-кратного последовательного пассирования 100-150 тыс.кл/мл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных фибробластов почки овец проявляется через 72-96 ч после перевивки и охватывает все его площади в период между 96120 ч. Антигенные свойства. Штамм--0164(КазНИВИ) 04/07 вируса лейкоза крупного рогатого скота в организме привитых КРС, овец, коз и кроликов стимулирует образование вируснейтрализующих(КазНИВИ) 04/07 вируса лейкоза крупного рогатого скота не патогенный. У привитых животных не иммунных к вирусу лейкоза вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител, которые формируются на 15-90 сутки. Иммуногенные свойства. Штамм-0164(КазНИВИ) 04/07 ВЛКРС репродуцированный в культурев дозе от 5 х 107 клетокпри подкожном или внутримышечном введении у животных вызывает пожизненное образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител, которые формируются на 15-90 сутки. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма вируса лейкоза крупного рогатого скота, штамм-0164 (КазНИВИ) 04/07 сохраняются при культивировании в культурена протяжении 200 пассажей. Сохраняемость. Штамм - -0164(КазНИВИ) 04/07 в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 4 в течение 30 суток,минус 18-20 - 3 месяцев, минус 40 - 6 месяцев,а в жидком азоте в течение 5 лет (срок наблюдения). Лиофилизированный антиген вируса лейкоза в смеси со стабилизирующей средой, содержащей среду Игла 80, сахарозу 10, эмбриональной сыворотки 20 сохраняет биологическую активность при температуре 41 в течение не менее 24 месяцев. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Для наработки вирусосодержащей культуральной жидкости, штамм --0164(КазНИВИ) 04/07 ВЛКРС репродуцируют в монослойной культуре почки эмбриона овцы ,стационарным способом, в среде ИГЛА-,содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл линкомицина и 300 мг глютамина. Для перевивки на новый цикл наработки антигена вируса лейкоза, клетки снимают со стекла смесью растворов 0,02 версена и 0,25 трипсина или химопсина в соотношении 91, ресуспендируют в выше указанной среде. Засевают в стеклянные сосуды и инкубируют в термостате при температуре 36-37 С в течение 4-7 дней, со сменой среды через каждые 1 или 2 суток. Посевная концентрация клеток составляют 100-150 тысяч на 1 мл ростовой среды. После формирования монослоя из сосуда с монослойной культурой клеток сливают ростовую вируссодержащую среду, вносят поддерживающую,содержащую в составе среду ИГЛА- до 5 эмбриональной телячьей сыворотки. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 48-120 ч, с ежедневным сбором вируссодержащей культуральной жидкости. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса, сосуд с клетками встряхивают, сливают культуральную жидкость и вместе с ранее собранными вирусными материалами подвергают замораживанию при температуре минус 20 и размораживают при комнатной температуре или при температуре 37. Из культуральной жидкости удаляют клеточные детриты путем центрифугирования при 2-3 тыс. оборотов в течение 15-20 мин при 4 и концинтрируют путем осаждения вируса на полиэтиленгликоле и диализа на полумембранных мешочиках. Полученный концентрированный антиген используют в качестве целового препарата для иммунизации животных. Пример 2. Для получения гипериммунной сыворотки к ВЛКРС используют кроликов, из которых сформируют 2 группы опытную и контрольную. Иммунизацию проводят путем внутримышечного введения тремя однократными циклами концентрированного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота,3 гомогенизированного с ровным объемом неполным адъювантом Фрейнда в дозе 1 мл на животное(первый цикл), 1,5 мл (второй цикл) и 2 мл (третий цикл) 1 раз в сутки с интервалом 15 и 21 суток. Животных второй контрольной группы содержат без иммунизации. Сыворотки крови кроликов исследуют до введения антигена, через 30 и 60 дней от начала эксперимента в реакции иммунодиффузии в агаровом геле с использованием коммерческого диагностического набора РИД, производства Курской государственной биофабрики РФ. Результаты РИД учитывают согласно инструкции по применению диагностического набора фирмыизготовителя. По данным РИД, ни у одной особи обеих групп в сыворотке крови до иммунизации антитела к антигену ВЛКРС не должны выявляться. При выявлении антител к ВЛКРС у кроликов первой группы через 60 суток в титре от 18 до 132,сыворотка считается пригодным для выделения иммуноглобулина. От кроликов с высокими титрами антител из яремной вены получают кровь и отстойным методом выделяют гипериммунную сыворотку. Кролики второй контрольной группы должны реагировать отрицательно в течение указанных сроков. Пример 3. Из полученной гипериммунной сыворотки выделяют гамма-глобулиновую фракцию белка спиртовым методом Кона и методом осаждения глобулинов сернокислым аммонием. Для чего в начале из гипериммунной сыворотки осаждают гамма и бета глобулинов, затем отделяют бета глобулина и после из надосадочной жидкости гамма-глобулиновой фракции. Для выделения глобулиновиспользуемой сыворотки доводят до 7,0-7,2 с добавлением ацетатного буфера 1. Затем к 500 мл охлажденной до 0 сыворотки приливают тонкой струей 442 мл 53 раствора этилового спирта ректификата,охлажденного до минус 15. Полученную суспензию хорошо перемешивают и помещают в холодильник при минус 6 на 10-12 часов для выпадения в осадок глобулинов, которые отделяют путем центрифугирования при 8000-10000 об/мин в течение 20 мин при температуре минус 4. Выделение бета-глобулиновой фракции проводят присмеси 5,0-5,1 с добавлением к раствору глобулинов ацетатного буфера 2. Осадок глобулинов, полученный при первом осаждении взвешивают и размешивают на холоде до гомогенной взвеси в двух объемах (г/объем) охлажденного до 0 С физиологического раствора. К полученному гомогенату добавляют охлажденную до 0 дистиллированную воду в количестве 9,5 мл на 1 г осадка. Смесь охлаждают в течение 2,5 часов при температуре минус 10, добавляют равный объем охлажденного до 11 26 раствора спирта,хорошо перемешивают и помещают в холодильник при температуре минус 4 на 10-12 часов. При этом в осадок выпадают бета - глобулиновая фракция, которую отделяют центрифугированием при 8000-10000 в течение 20 мин при минус 4 Для выделения гамма-глобулина надосадок бета 25847 глобулина подщелачивают 1 М раствором бикарбоната натрия до 7,0-7,2 и к ней добавляют 1,5-1,7 г сухой соли хлористого натрия,выдерживают в течение 1-2 часов при температуре минус 3, а затем приливают 53 спирта,охлажденной до минус 15, из расчета 0,4 л на 1 л раствора. Полученную смесь хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике при температуре минус 6 С на 10-12 часов для формирования осадка. После надосадок сливают, а осадок гамма-глобулина центрифугировают при 10000 об/мин и минус 5 в течение 20 мин. Полученный гамма-глобулин взвешивают и ресуспендируют в двух объемах охлажденным физиологическим раствором и используют для изготовления иммуноглобулинового конъюгата для ИФА. Пример 4. Для приготовления одной серии конъюгата берут 4 мг пероксидазы хрена (ПХр) с показателем чистоты 2.7-3.0 и удельной активностью 850 и более ЕД по 4 аминоантрипину,растворяют в 1 мл охлажденной дистиллированной воды. К полученному раствору ПХр добавляют 200 мкл свежеприготовленного раствора перйодата,приготовленный раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 20 мин при комнатной температуре, затем приливают 6 капель этиленгликоля и выдерживают смесь еще 5 мин при комнатной температуре. Затем подвергают диализу против 0,001 М натрийацетатный буфер,4,4 в течение ночи при 4. К этой фракции добавляют 20 мкл натрийацетатного буфера для доведенияприблизительно до 9,0 - 9,5 и 8 мг вирусоспецифического иммуноглобулина. Смесь оставляют при комнатной температуре на 3 ч.,перемешивая с помощью магнитной мешалки. Полученной фракции конъюгата диализируют против боратного буфера в течение ночи при 4. К полученной фракции конъюгата добавляют равный объем 60-ного глицерина в боратном буфере и оставляют для работы при 4 Контроль активности изготовленного конъюгата осуществляют путем определения его рабочего титра в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа. Для чего готовят разведения антигенов с концентрацией от 20 до 2560 нанограмм мл в 0,05 М бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6) и вносят по 0,1 см 3 в убывающем порядке в горизонтальные ряды планшета. Затем планшет закрывают крышкой и оставляют в холодильнике при 4 на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, и планшет отмывают четырехкратно содержащее 0,05 твина 20(ЗФР-Т). Для блокировки свободных поверхностей твердой фазы в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина в ЗФР. Через 1 час после инкубации при 37 содержимое лунок удаляют и планшет отмывают вышеописанным способом. Затем готовят разведения конъюгата - 1250,1500, 11000 и 12000 в ЗФР-Т, из каждого разведения коньюгата вносят по 0,1 см 3 в лунки горизонтального ряда планшета. Затем планшет инкубируют в термостате при 37 в течение 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяя процедуру отмывки планшета, и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 вежеприготовленной субстратной смеси. Затем планшет закрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по ОД см 3 стоп-реагента. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темно-коричневого окрашивания,при отрицательной реакции содержимое лунок остается бесцветным или имеет бледно-желтое окрашивание. Результаты определения рабочего титра иммуноферментного конъюгата приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что рабочий титр полученного пероксидазного конъюгата,приготовленного из гамма-глобулиновой фракции белка, выделенный из гипериммунной сыворотки кролика составляет 1500, который выявляет антиген в биологическом материале в концентрации 20-40 нанограмм мл. Конъюгат такой с концентрацией считается пригодным для постановки ИФА, для выявления вируса в биологическом материале при диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование способа приготовления иммуноферментной тест-системы для выявления вируса лейкоза КРС в биологическом материале позволит повысить специфичность,чувствительность и выявлять инфицированный организм в ранние сроки и разработать эффективные схемы профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота. Таблица 1 Результаты определения рабочего титра иммуноферментного конъюгата в ИФА Концентрация антигена, нг ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Иммуноферментная тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота,содержащая иммуносорбент, иммуноферментный конъюгат из иммуноглобулинов крупного рогатого скота,бикорбанатный буфер и хромоген, отличающийся тем, что в качестве специфического реагента она содержит антивидовой иммунопероксидазный конъюгат с рабочим титром 1500, полученный из антител, выделенных из специфической сыворотки кроликов.