Способ прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности

(2006.01), 01 33/48 (2006.01), 01 33/49 (2006.01), 01 33/86 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ выделенной из переферической крови, а в качестве маркеров исследуют биомаркеры,гены аполипопротеин С 3 и аполипопротеин Е,прогнозируя предрасположенность к плацентарной недостаточности у пациенток, в качестве которых исследуют женщин казахской популяции с привычным невынашиванием в анамнезе, при наличии генотипа С/С при популяционной частоте генотипа 8,0 3,83 и коэффициенте риска развития заболевания 8,6 и наличии генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е при популяционной частоте генотипа 36,02,86 и коэффициенте риска развития заболевания 10,69 прогнозируют предрасположенность к плацентарной недостаточности и отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности прогнозируют при отсутствии мутантного генотипа С/С или при наличии генотипа /, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,13 и при отсутствии мутантного генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е и наличии генотипов Е 2/Е 2,Е 2/Е 3, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,2 При этом выделение ДНК из переферической крови пациенток проводят на станции выделения ДНК 6100(76) Мамедалиева Нагима Мусралиевна ,Святова Гульнар Салаватовна(56) Предварительный патент РК 11583, кл. А 61 В 10/00, 01 33/50, 01 33/53, 2000(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии и может быть использовано для прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности у беременных женщин. Техническим результатом изобретения является расширение функциональных возможностей и арсенала средств назначения Это достигается тем, что в предлагаемом способе прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности,включающем исследование крови пациенток, диагностирование с применением маркеров, в качестве индикаторов контроля,согласно изобретению,проводят молекулярно-генетическое исследование ДНК, 21959 Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии и может быть использовано для прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности у беременных женщин. Известен способ прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности , заключающийся в том, что в 1-й и 21-й дни менструального цикла по варианту 1 определяют динамику депрессии противосвертывающей системы крови, характеризуемую для каждой пациентки индивидуальным показателем (ИПддпс),значение которого 0,4 диагностируется как предрасположенность к плацентарной недостаточности,а значение ИПддпс 0,6 характеризует отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности. По варианту 2 аналогичным образом определяют динамику антиоксидантного потенциала крови,характеризуемую индивидуальным показателем(ИПддап) значение которого 0,2 диагностируется как предрасположенность к плацентарной недостаточности, а значение ИП ддап 0,5 характеризует отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности в период беременности, либо при ее отсутствии.(Пат.2 180 756, кл.0133/86, 33/50,2002) К недостаткам известного способа относятся его ограниченные функциональные возможности и ограниченный арсенал средств назначения, так как способ предусматривает прогнозирование предрасположенности к плацентарной недостаточности у здоровых пациенток любой популяции. Известен способ доклинического прогнозирования плацентарной недостаточности путем исследования крови, согласно которого определяют содержание молекул средней массы в сыворотке крови и при показателе более 0,220, 0,230 и 0,240 усл. ед. соответственно в первом, втором и в третьем триместрах беременности прогнозируют развитие плацентарной недостаточности.(Пат.2 148 256, кл.0133/49, 33/48,2000) К недостаткам известного способа относятся его ограниченные функциональные возможности и ограниченный арсенал средств назначения, так как способ предусматривает прогнозирование предрасположенности к общей форме плацентарной недостаточности у здоровых пациенток любой популяции Известен, также, способ диагностики плацентарной недостаточности (способ прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности), включающий биохимическое исследование крови, согласно которого исследуют плацентарные белки (маркеры), трофобластический бетта-глобулин, плацентоспецифический альфамикроглобулин и альфа-один -микроглобулин фертильности и при значении трофобластическиго бетта-глобулина в пределах 1666,1-2000,0 нг/мл,плацентоспецифического альфа-микроглобулина 12,5-19,3 нг/мл и альфа- один -микроглобулина фертильности - 546,3-597,7 нг/мл диагностируют первичную плацентарную недостаточность, при значениях трофобластическиго бетта-глобулина в пределах 2036,7-2600,7 нг/мл, плацентоспецифического альфа-микроглобулина - 20,2 - 26,6 нг/мл и альфа- один -микроглобулина фертильности - 842,7911,7 нг/мл диагностируют хроническую плацентарную недостаточность, при значении трофобластическиго бетта-глобулина в пределах 2621,4-3423,4 нг/мл,плацентоспецифического альфа-микроглобулина - 34,9 - 44,6 нг/мл и альфаодин -микроглобулина фертильности - 926,1- 1005,3 нг/мл диагностируют абсолютную плацентарную недостаточность.(Пред. Пат 11583, кл. А 61 В 10/00, 0133/50, 0133/53,2002) К недостаткам известного способа относятся его ограниченные функциональные возможности и ограниченный арсенал средств назначения, так как способ предусматривает прогнозирование предрасположенности к общей форме плацентарной недостаточности у здоровых пациенток любой популяции. Задачей изобретения является создание способа прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности позволяющего расширить функциональные возможности и арсенал средств назначения. Техническим результатом изобретения является расширение функциональных возможностей и арсенала средств назначения Это достигается тем, что в предлагаемом способе прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности,включающем исследование крови пациенток, диагностирование с применением маркеров, в качестве индикаторов контроля,согласно изобретению,проводят молекулярно-генетическое исследование ДНК,выделенной из переферической крови, а в качестве маркеров исследуют биомаркеры,гены аполипопротеин С 3 и аполипопротеин Е,прогнозируя предрасположенность к плацентарной недостаточности у пациенток, в качестве которых исследуют женщин казахской популяции с привычным невынашиванием в анамнезе, при наличии генотипа С/С при популяционной частоте генотипа 8,0 3,83 и коэффициенте риска развития заболевания- 8,6 и наличии генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е при популяционной частоте генотипа 36,0 2,86 и коэффициенте риска развития заболевания 10,69 прогнозируют предрасположенность к плацентарной недостаточности и отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности прогнозируют при отсутствии мутантного генотипа С/С или при наличии генотипа/, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,13 и при отсутствии мутантного генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е и наличии генотипов Е 2/Е 2, Е 2/Е 3, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,2. При этом выделение ДНК из переферической крови 21959 пациенток проводят на станции выделения ДНК 6100, США Предлагаемый способ прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности реализуют следующим образом. Для прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности проводят молекулярно-генетическое исследование ДНК,выделенной из переферической крови с выявлением гомозиготного генотипа С/С в гене аполипротеина С 3 (Аро С 3) и мутантных генотипов Е 3/Е 4 в гене аполипопротеина Е (Аро Е), которые исследуют, в качестве биомаркеров. Предрасположенность к плацентарной недостаточности прогнозируют у пациенток, в качестве которых исследуют женщин казахской популяции с привычным невынашиванием в анамнезе. Выделение ДНК из периферической крови обследуемых пациенток проводят на станции выделения ДНК 6100(США), и тестированием на 3 агарозном геле. Генотипирование проводят путем амплификации ДНК в полимеранозной цепной реакции (ПЦР) с применением олигонуклеотидных праймеров. Анализ полиморфизма Аро С 3 32 цикла ПЦР проводят по следующей программе 94 С-1 сек 60 С-1 сек 72 С-1 сек В первом цикле стадия денатурации составляет 5 минут, в последнем цикле стадия синтеза цепи - 7 минут. Последующий рестрикционный анализ проводят с использованием ферментов 1. В 0,5 мкл рестрикционной смеси добавляют 12 мкл амплификата,после центрифугирования термостатируют при 37 С в течении 12 часов. Продукты амфликации анализируют с помощью электрофореза в 6-ном полиакриламидном геле,нанося в лунки геля 112 мкл реакционной смеси. Гель окрашивают бромистым этидием. Для анализа полиморфизма Аро Е 30 циклов ПЦР проводят по следующей программе 94 С-45 сек 62 С-45 сек 72 С-45 сек В первом цикле стадия денатурации составляет 5 минут, в последнем цикле стадия синтеза цепи - 5 минут. Последующий рестрикционный анализ проводят с использованием ферментов . В 0,5 мкл рестрикционной смеси добавляют 15 мкл амплификата,после центрифугирования термостатируют при 50 С в течении 4 часов. Продукты амфликации анализируют с помощью электрофореза в 6-ном полиакриламидном геле,нанося в лунки геля 112 мкл реакционной смеси. Гель окрашивают бромистым этидием. Проведен анализ частот генотипов гена Аро С 3 и Аро Е у 50 беременных женщин казахской популяции с привычным невынашиванием в анамнезе Контрольную группу составили 100 беременных с физиологически протекающей беременностью. Результаты представлены в таблицах 1,2. Как видно из таблиц 1,2, при наличии генотипа С/С при популяционной частоте генотипа 8,0 3,83 и коэффициенте риска развития заболевания 8,6 и наличии генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е при популяционной частоте генотипа 36,02,86 и коэффициенте риска развития заболевания 10,69 прогнозируют предрасположенность к плацентарной недостаточности и отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности прогнозируют при отсутствии мутантного генотипа С/С или при наличии генотипа /, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,13 и при отсутствии мутантного генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е и наличии генотипов Е 2/Е 2,Е 2/Е 3, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,2. Таблица 1 Частота полиморфных вариантов гена Аро С 3 у беременных с диагностированной плацентарной недостаточностью и привычным невынашиванием в анамнезе, у беременных с привычным невынашиванием без признаков плацентарной недостаточности при данной беременности и беременных с нормальной репродуктивной функцией. генотип Примечаниеимеются достоверные различия р 0,05 р 0,001 21959 Таблица 2 Частота полиморфных вариантов гена Аро Е генотип Е 2 Е 2 Е 2 Е 3 Е 3 Е 3 Е 3 Е 4 Е 4 Е 4 всего Примечаниеимеются достоверные различия р 0,05 р 0,001 Исследование частоты носительства полиморфных вариантов гена Аро СЗ и гена Аро Е позволило рассчитать коэффициентСилу ассоциации выражали в значениях относительного риска , рассчитанного как относительный шанс-( х )/(с) Где а- число лиц с наличием и -с отсутствием генетического маркера среди больных,и - число лиц соответственно с наличием и отсутствием этого маркера среди здоровых. Пример 1 Беременная С, возраст 34 года, поступила в клинику 30.01.07 г. с диагнозом беременность 23-24 недели, отягощенный акушерский анамнез, привычное невынашивание, хроническая плацентарная надостаточность,хроноческий пиелонефрит,ремиссия, умеренная анемия. Из анамнеза менструальная функция без особенностей, гинекологическое заболевание хроническое воспаление придатков.. 2005 - ангенатальная гибель плода в 24-25 недель.-2007-данная Беременная клинически обследована. Клиниколабораторные исследования в пределах нормы. Данные доплерометрии - маточно-плацентарный кровоток нарушен за счет обеих маточных артерий. Плодово-плацентарный кровоток нарушен за счет артерии пуповины, отсутствует диастола. Заключение нарушение 3 ст., критическое состояние плода. Для определения предрасположенности к плацентарной недостаточности проведено тестирование гена Аро С 3 и Аро Е. У пациентки выявлен неблагоприятный мутантный генотип СС гена Аро СЗ и генотип ЕЗ/Е 4 гена. Аро Е. 03.02 07 пациентка родоразрешена через естественные родовые пути, произошли роды мертвым недоношенным плодом, весом 430 г. Пример 2. 4 Беременная Б, возраст 34 года, поступила в клинику 15.02.08 г. с диагнозом беременность 32-33 недели после ЭКО и ПЭ. Отягощенный акушерский анамнез, хроническая плацентарная недостаточность,НЦД по смешанному типу, хронический пиелонефрит,ремиссия. Из анамнеза Менархе с 12 лет, нарушение менструального типа по типу полименореи. Гинекологический анамнез 2003 г.-внематочная беременность, тубэктомия справа..2008- данная Беременная клинически обследована. Данные кардиотокографии ПСП 2,1. Данные доплерометрии выраженные нарушения кровообращения плода, критическое состояние плода. Для определения предрасположенности к плацентарной недостаточности проведено тестирование гена Аро С 3 и Аро Е. У пациентки выявлен неблагоприятный мутантный генотип СС гена Аро С 3 и генотип Е 3/Е 4 гена. Аро Е 17.02.08. - пациентка родоразрешена оперативным путем в плановом порядке. Извлечен живой недоношенный плод мужского пола весом 2100,0 г, рост 45 см, с оценкой по шкале Апгар 2-46. Ребенок переведен на второй этап выхаживания в институт педиатрии. Таким образом предлагаемый способ,прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности позволяет расширить функциональные возможности и арсенал средств назначения 21959 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ прогнозирования предрасположенности к плацентарной недостаточности, включающий исследование крови пациенток, диагностирование с применением маркеров, в качестве индикаторов контроля, отличающийся тем, что проводят молскулярно-генетическое исследование ДНК,выделенной из периферической крови, а в качестве маркеров исследуют биомаркеры,гены аполипопротеин С 3 и аполипопротеин Е,прогнозируя предрасположенность к плацентарной недостаточности у пациенток, в качестве которых исследуют женщин казахской популяции с привычным невынашиванием в анамнезе, при наличии генотипа С/С при популяционной частоте генотипа 8,03,83 и коэффициенте риска развития заболевания 8,6 и наличии генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е при популяционной частоте генотипа 36,02,86 и коэффициенте риска развития заболевания 10,69 прогнозируют предрасположенность к плацентарной недостаточности и отсутствие предрасположенности к плацентарной недостаточности прогнозируют при отсутствии мутантного генотипа С/С или при наличии генотипа /, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,13 и при отсутствии мутантного генотипа Е 3/Е 4 гена аполипопротеина Е и наличии генотипов Е 2/Е 2,Е 2/Е 3, при котором коэффициент риска развития заболевания 0,2 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение ДНК из периферической крови пациенток проводят на станции выделения ДНК 6100, США