Гепатопротектор

(51)7 61 31/675 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Витик Андрей Зиновьевич Газалиев Арстан Мауленович Гуляев Александр Евгеньевич(56) Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом поражении печени / Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М., 1991, с. 5, 32-33.,-диалкоксифосфорилметильных производных цитизина и их внутренних солей в условиях реакции(57) Изобретение относится к фосфорсодержащим производным цитизина общей формулы,где 01 при 0 Х ОСН 3 25 С 3 Н 7- С 3 Н 7 С 49 при 1 ХО СН 3 1- С 3 Н 7 С 6 Н 5 -СН 3 О-. Показано, что некоторые из синтезированных соединений проявляют значительную гепатопротекторную и антиферментную активность. 9910 Изобретение относится к новым химическим соединениям, в частности, к фосфорсодержащим производным цитизина, проявляющим гепатопротекторную и антиферментную активность. Известно, что алкалоид цитизин (1), впервые выделенный из семян ракитника и термопсиса, в настоящее время широко используется в медицинской практике в виде 0,15 водного раствора (цититон) в качестве аналептического средства (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1977, ч. 1, с. 123)(в) Синтез О,О-диалкилцитизинилфосфатов (-0,Х-О соединения 4 а-д) осуществляли взаимодействием диалкилфосфитов с цитизином в условиях реакции Тодда-Атертона по следующей схеме, (а) где -2-5 алкил. Характерным свойством цитизина является способность его возбуждать дыхание, связанная с рефлекторной стимуляцией дыхательного центра усиленными импульсами, поступающими от каротидных клубочков. Одновременное возбуждение симпатических узлов и надпочечников приводит к повышению артериального давления. В связи с этим цитизин рекомендуют использовать в случаях остановки дыхания и сердечной деятельности при интоксикациях. Цитизин широко распространен в природе. Он найден во многих растениях и извлечение его из растительного сырья ионообменным методом является главным промышленным способом получения цитизина. В работах (Докл. АН Узб. ССР, 1978,9, с. 3942 Докл. АН Узб. ССР, 1977,7, с. 40-43) описан синтез фосфорсодержащих (диалкоксифосфинил) меркаптоэтил цитизинов (2) и их иодметилатов(3). Авторы показали, что все синтезированные соединения обладают необратимой ингибирующей активностью в случае ацетилхолинэстеразы и проявляют эффект избирательного торможения каталитической активности бутирилхолинэстеразы. Сведения о других фосфорсодержащих производных цитизина нами в литературе не обнаружены. В связи с тем, что исходный алкалоид цитизин проявляет значительную биологическую активность,можно предположить, что и другие его фосфорсодержащие производные будут интересны с этой точки зрения. Получение новых фосфорсодержащих производных цитизина, в частности, обладающих повышенной биологической активностью, достигается тем,что получены фосфорсодержащие производные цитизина общей формулы(-0, - соединения 5 а-д) осуществляли в две стадии. На первой стадии при взаимодействии цитизина с диалкилхлорфосфитом (Нифантьев Э.В. Химия фосфорорганических соединений. М. Наука, 1983,с. 85) в среде бензола, в токе сухого аргона и в присутствии триэтиламина образуется промежуточный О,О-диалкилцитизинилфосфит, который затем реагирует с эквимолярным количеством элементной серы с образованием О,О-диалкилцитизинилтиофосфата(-1, Х-О, -СН 3 соединения 6 а-в) получены взаимодействием цитизина с альдегидами и диметилфосфитом в условиях реакции Кабачника-Филдса Варианты осуществления изобретения. Следующие примеры поясняют изобретение подробнее, не ограничивая его этим. Примеры 1. Синтез О,О-диметилцитизинилфосфата (4 а) В колбу помещают смесь 2,86 г (0,026 моль) диметилфосфита и 15,5 мл (0,16 моль) четыреххлористого углерода в 100 мл бензола и при перемешивании прикапывают к ней смесь 5 г (0,026 моль) цитизина и 2,63 г (0,026 моль) триэтиламина в 230 мл сухого бензола с такой скоростью, чтобы температура раствора не превышала 20 С. 9910 После окончания прикапывания реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Выпавшие кристаллы солянокислого триэтиламина отфильтровывают, растворитель отгоняют на вакуумном испарителе. Получают 5,64 г(выход - 72,5 от теоретического) кристаллического вещества (перекристаллизация из бензола) с температурой плавления 158-159 С. ИК-спектр, , см-1 1270(Р-), 1050(РС),830, 1658(-). Спектр ПМР, , м.д. 6,23 д (1, СН, 3 нн 5,0 Гц),7,23 д.д.(1 Н, СН, 3 нн 3,2 Гц),Брутто формула - С 131924 Вычислено,С 52,36 Н 6,379,40 Р 10,40 По данным рентгеноструктурного анализа координация атома фосфора в молекуле О,О-диметил- цитизинилфосфата - искаженная тетраэдрическая,обычная для фосфатных группировок. Дигидропиридиновый цикл - плоский с точностью 0,01 Е,карбонильный атом кислорода отклоняется от этой плоскости незначительно (на 0,07 Е). Тетрагидропиридиновый цикл принимает конформацию кресла(С 3 2,7) с выходом мостикового атома С из средней плоскости остальных на 0,75 Е. Пиперидиновый цикл имеет почти идеальную конформацию кресла(С 3 0,5). Метильные группы СН 3 имеют гошориентацию относительно связей Р- и Р-, соответственно. Аналогично получены другие соединения 4 б-в этого ряда (таблица). Таблица Физико-химические константы и данные элементного анализа предлагаемых соединений(5 а). В колбу помещают 5 г (0,026 моль) цитизина и 2,63 г (0,026 моль) триэтиламина в 200 мл абсолютного бензола. При энергичном перемешивании в токе сухого аргона и при комнатной температуре прибавляют 3,33 г (0,026 моль) диметилхлорфосфита. Перемешивают 5 часов. Выпавший осадок гидрохлорида триэтиламина отфильтровывают, промывая порциями абсолютного бензола. Фильтрат и расчетное количество серы 0,83 г (0,026 моль) помещают в колбу и продолжают перемешивать при комнатной температуре еще 2 часа. Затем смесь упаривают на роторном испарителе и остаток перекристаллизовывают из бензола. Получают 8,01 г 7,16 д.д. (1, , 3 нн 5,8 Гц) 5,8 д (1 Н, СН ),3,40 д (6 Н, СН 3 О, СН 312,0 Гц). ЯМР 31 р-10,22 м.д Найдено,С 49,91 Н 6,138,87 Р 9,69 131923 Вычислено,С 49,68 Н 6,058,91 Р 9,87 Аналогично получены и соединения 5 б-д этого ряда. Результаты приведены в таблице. 3. Синтез диметил-2-(-цитизинил)-2-изобутилфосфоната (6 а). Смесь 3,8 г (0,02 моль) цитизина, 1,24 г (0,02 моль) изомасляного альдегида, 2,2 г (0,02 моль) диметилфосфита и каталитического количества 18-краун-6 в 100 мл бензола кипятят 3 часа с одновременной отгонкой образующейся в ходе реакции воды. После отгонки растворителя по окончании реакции остаток промывают гексаном и перекристаллизовывают из смеси бензол-эфир. Получают 5,52 г (выход 78,1 ИК-спектр, , см 1220(Р-), 1070(РС). Спектр ПМР, , м.д. 6,72 д (1, СН, 3 нн 8,6 Гц) 7,10 д.д.(1 Н, СН, 3 6,4 Гц) 6,51 д (1 Н, СН),3,31 д (6 Н, СН 3 О, 312,6 Гц) 0,50 д (3 Н, СН 3-С),Найдено,С 57,70 Н 7,728,038,67 172724 Вычислено,С 57,56 Н 7,587,90 Р 8,52 Аналогично получены и соединения 6 б-в этого ряда (таблица). Биологическая активность предлагаемых соединений. Проведенные фармакологические исследования показали, что синтезированные соединения проявляют гепатопротекторную и антиферментную активности.. Изучение гепатопротекторной активности. Острая токсичность соединения Среднелетальную дозу 50 определяли на мышах белых рандомбредных (320 голов по 1820 грамм каждая). Препарат вводили однократно внутривенно в физиологическом растворе или перорально в крахмальной 1 взвеси. Период наблюдения - 14 дней. Ежедневно проверяли общее состояние животных, в течение периода наблюдения 3 раза животных взвешивали, проводили вскрытие павших животных и макроскопическое описание. Определение 50 проводили методом проб и анализа. В результате проведенных экспериментов получили, что 50 - 4300 мг/кг (3200-5800) при пероральном введении соединения и 50 - 1800 мг/кг(1250-2550) при внутривенном введении. Приведена средняя арифметическая величина и доверительный полуинтервал при Р - 95 . Гепатопротекторная активность при остром токсическом гепатите у крыс. По мнению фармакологов, наиболее эффективным гепатопротекторным препаратом в настоящее время является препарат Эссенциале (ФРГ), который и был использован в следующих экспериментах в качестве препарата сравнения. Этот препарат представляет собой сложный комплекс веществ и содержит в своем составе сумму флаваноидов, фосфолипидов, никотинамид и различные витамины. Изучение гепатопротекторной активности предлагаемого препарата при остром токсическом гепатите проводили на 4 группах самцов белых рандомбредных крыс массой 120-150 грамм по 10 особей в каждой. Первая группа - животным вводили внутривенно 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и через час внутрибрюшинно 0,4 мл вазелинового масла. Вторая группа - внутривенно 0,1 мл изотонического раствора хлористого натрия и через час внутрибрюшинно 0,4 мл 40 раствора гепатотропного яда - четыреххлористого углерода в вазелиновом масле. 4 Третья группа - внутривенно 0,1 мл раствора Эссенциале (50 мг/кг) и через час внутрибрюшинно 0,4 мл 40 раствора 4 в вазелиновом масле. Четвертая группа - внутривенно 0,1 мл водного раствора заявляемого вещества (50 мл/кг) и затем через час внутрибрюшинно 0,4 мл 40 раствор СС 4 в вазелиновом масле. Все инъекции повторяли один раз в сутки на протяжении четырех дней, после чего под эфирным наркозом животные были декапитированы. Гепатопротекторную активность предлагаемого препарата и препарата сравнения при отравлении крыс четыреххлористым углеродом оценивали по изменению биохимических и гистологических показателей, характеризующих степень повреждения(разрушения) клеток при отравлении. Исследовали активность фермента аланинаминотрансферазы(АЛаТ) и уровень общего билирубина в крови, хемолюминесценцию эритроцитов и морфометрически объемную долю некрозов, внутридольковой инфильтрации, регенерирующих и дистрофированных клеток в срезах ткани печени. При изучении хемолюминесценции эритроциты,выделенные из крови, суспензировали в изотоническом растворе хлорида натрия (по 1 мл 10 взвеси эритроцитов в пробе), свечение стимулировали 0,1 мл 5 Н 2 О 2 и определяли среднеарифметические показатели интегральной площади под кривой хемолюминесценции. Группа 1 2 3 4 Площадь под кривой хемолюминесценции 4,34 9,395 7,35 5,386 Приведенные данные показывают, что предлагаемое вещество обладает гепатопротекторной активностью при отравлении крыс четыреххлористым углеродом, причем действует более активно, чем препарат Эссенциале, использованный в качестве препарата сравнения. Действие на выживаемость мышей при отравлении их гепатотропным ядом. 1. Для изучения действия препарата на выживаемость мышей при отравлении гепатотропным ядом использовались мыши белые рондомбредные,самцы массой 18-20 грамм, три группы по 10 мышей в каждой. Первой группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1 мл изотонического раствора хлорида на 9910 трия. Второй группе - внутривенно 0,1 мл раствора Эссенциале в дозе 50 мг/кг. Третьей группе внутрибрюшинно 0,1 мл раствора предлагаемого вещества в водном растворе (100 мг/кг). Через час после первого введения всем животным внутрибрюшинно ввели 0,1 мл 50 раствора четыреххлористого углерода в вазелиновом масле. Инъекции проводили однократно. Срок наблюдения - 5 суток. Выживаемость через 5 суток составила Группа 1 2 3 Число выживших животных 0 2 8 Полученные результаты показывают, что предлагаемое соединение в большей степени, чем Эссенциале, защищает животных от гибели при отравлении их гепатотропным ядом. Таким образом, мы установили, что соединение обладает умеренной токсичностью и его гепатопротекторное действие в эксперименте на животных значительно превосходит действие препарата Эссенциале. 2. Хорошие результаты по выживаемости мышей при отравлении их гепатопротекторным ядом показало и еще одно из предлагаемых фосфорсодержащих производных цитизина. Процент выживаемости для этого соединения в эксперименте, аналогичном вышеописанному, составил 80 .. Изучение антиферментной активности При исследовании антиферментной активности синтезированных соединений изучали их взаимодействие с ацетилхолинэстеразой (АХЭ) и бутирилхолинэстеразой (БуХЭ). Использовали АХЭ из эритроцитов крови человека с удельной активностью 1,2 Ед/мг и БуХЭ из сыворотки крови лошади с удельной активностью 9,6 Ед/мг. Активность АХЭ и БуХЭ определяли калориметрическим методом Эллмана при 25 С в 0,2 М -фосфатном буфере, рН 7,5. В качестве субстрата использовали иодид ацетилтиохолина фирма(ЧСФР). Эффективность обратимых ингибиторов определяли по методу А.П. Бресткина и характеризовали величиной обобщенной ингибиторной константы (К), которая при смешанном типе торможения связана с конкурентной (К) и бесконкурентной (К 1) составляющими соотношением 1/ - 1/К 1/К 1. Активность цитохрома Р 450 определяли двумя методами по скорости гидроксилирования 3,4 бенз/а/пирена, путем флуориметрического опреде ления образующегося 4-гидроксибенз/а/пирена и по скорости диэтилирования 7-этоксикумарина путем флуориметрического определения образующегося 7 гидроксикумарина. Ингибирующее влияние исследуемых веществ на ЦТ Р 450 оценивали по величинам 50, представляющим собой обратный логарифм концентрации агента, вызывающей активности на 50 . Установлено, что цитизинилфосфаты и цитизинилтиофосфаты являются ингибиторами АХЭ средней силы и весьма эффективными ингибиторами БуХЭ. Наибольшую избирательность по отношению к БуХЭ наблюдали для производных тиофосфата(рК 1-6,7 и рК 1-6,1, соответственно). Выявлены сильные ингибиторы цитохрома Р 450,- имеющие перспективу для практического использования, среди них - соединение с 50-5,55 и соединение с 50 -5,70. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение фосфорсодержащих производных цитизина общей формулы в качестве гепатопротектора. 2. Применение фосфорсодержащих производных цитизина по п. 1 общей формулы где 0 1 в качестве гепатопротектора. 3. Применение фосфорсодержащих производных цитизина по пп. 1, 2, где 1, в качестве лекарственного средства, обладающего гепатопротекторной активностью.