Штамм клубеньковых бактерий rhizobium leguminozarum sp. (pisum) г-2, используемый для получения бактериального препарата под горох

(51) 12 1/20 (2006.01) 05 11/08 (2006.01) 01 1/06 (2006.01) 01 21/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Казахстана под современные сорта гороха и обладающего высокой азотфиксирующей способностью и конкурентной способностью. Предложен новый штамм клубеньковых бактерий Г-2,применяемый в качестве средства для получения удобрения под горох. Штамм депонирован в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН Республики Казахстан КН МОН Республики Казахстан (коллекционный номер ИМиВ В-23 от 27.08.2014) и предназначен для получения бактериального препарата под горох с высокой азотфиксирующей активностью и конкурентной способностью клубеньковых бактерий. Конкурентная способность клубеньковых бактерийГ-2 равна 37,5,азотфиксирующая способность равна 13,5 нмоль 24/ч/1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Штамм проявляет высокий уровень роста на модифицированной среде с бобовым отваром,активно фиксирует атмосферный азот и обладает высокой конкурентной способностью. В ВосточноКазахстанской области при использовании штаммаГ-2 для гороха показано увеличение урожайности на 0,8-1,3 ц/га.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Треножникова Людмила Петровна Ултанбекова Гульнар Даулетбаевна Шорабаев Ерик Жарылкасынович(54) ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ.Г-2, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ПОД ГОРОХ(57) Изобретение относится к микробиологическим средствам повьппения урожайности бобовых растений и предназначено для изготовления бактериального препарата клубеньковых бактерий под горох. Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве бактериального удобрения. Задачей изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, используемого для получения бактериального препарата под горох,адаптированного для почв юго-восточного Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых растений и предназначено для изготовления бактериального препарата клубеньковых бактерий под горох. Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве бактериального удобрения. Предложен новый штамм клубеньковых бактерий Г-2,применяемый в качестве средства для получения удобрения под горох.Г-2 активно фиксирует атмосферный азот, обладает высокой конкурентной способностью и азотфиксирующей активностью, изученными на сортах гороха, районированных в почвенноклиматических условиях Костанайской,Акмолинской и Восточно-Казахстанской областях Казахстана. Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерийГ-2 для получения микробиологического удобрения,повышающего урожайность гороха. Клубеньковые бактерии рода способны инфицировать молодые корни бобовых растений, образуя клубеньки, в которых бактерии осуществляют фиксацию атмосферного азота и его биотрансформацию в формы, доступные для растений и микроорганизмов. Клубеньковые бактерии обладают видовой специфичностью, их вирулентность в значительной мере зависит от почвенно-климатических условий. В настоящее время для повышения урожайности бобовых культур используют бактериальные удобрения,изготовляемые на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий. При разработке биоудобрений основным является выбор эффективного штамма клубеньковых бактерий с высокой азотфиксирующей и конкурентной способностью, активно инфицирующего корневую систему бобовых растений в определенных почвенных условиях Нетрусова А.И. Практикум по микробиологии под редакцией. - М. . 2005. - С.116-129 Известен ряд штаммов клубеньковых бактерий для промышленного производства бактериальных препаратов под горох, описанных в патентах,например штамм клубеньковых бактерий гороха 250 б, предназначенный для изготовления бактериального удобрения нитрагина (Патент 979307, кл. 05 11/08,опубликовано 07.12.82). Известен штамм клубеньковых бактерий горохадля промышленного производства бактериальных препаратов под горох(Патент 2081535, кл. А 01 В 79/02, опубликовано 30.05.94). Известен штамм клубеньковых бактерий гороха 240 б как симбиотический азотофиксатор (Патент 698968, кл. 05 11/08,опубликовано 25.11.79). Штамм клубеньковых бактерий гороха 240 б повышает урожайность гороха на 1,5-4,4 ц/га по сравнению с посевами без обработки нитрагином. Их недостатком является то, что указанные штаммы отбирались и испытывались на сортах гороха, культивируемых в России, применительно к местным почвенно-климатическим условиям. При этом отсутствуют данные по эффективности этих штаммов в почвенно-климатических условиях основных регионов культивирования гороха в Казахстане. Задачей изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, используемого для получения бактериального препарата под горох,адаптированного для почв Казахстана под современные сорта гороха и обладающего высокой азотфиксирующей способностью и конкурентной способностью. Указанная задача решается за счет того, что для бактериального препарата под горох используется новый штамм клубеньковых бактерийГ-2. ШтаммГ-2 выделен из клубеньков гороха, произрастающего на посевах агрофирмы Камышинское в ВосточноКазахстанской области. Штамм депонирован в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН Республики Казахстан (коллекционный номер ИМиВ В-23 от 27.08.2014) и предназначен для получения бактериального препарата под горох с высокой азотфиксирующей активностью и конкурентной способностью клубеньковых бактерий. Штамм Г-2 характеризуется следующими морфологокультуральными и физиолого-биохимическими признаками. Морфологические и культуральные признаки. Культура неспороносная, грамотрицательная,клетки имеют палочковидную форму, подвижны. Штрих на среде с бобовым отваром обильный,слизистый, светло-кремовый, колонии круглые,выпуклые,гладкие,блестящие. Колонии появляются на 2-3 сутки. Размер клеток 3-суточной культуры на модифицированной среде - 0,5-0,91,23,0 мкм. Палочки в молодом возрасте подвижные,монотрихи. Бактероиды имеют вид более крупных палочек, чем клетки в молодом возрасте. Физиологические признаки. Штамм является аэробом,растет в температурном интервале 15-35 С, температурный оптимум 26-28 С при рН 6-7. Оптимум рН 7,0-7,2. Рост на МПА слабый.Г-2 растет на средах, состав которых приведен в таблице 1. Молоко с лакмусом не пептонизирует,подщелачивает, образуя небольшую слизистую зону на поверхности. Желатин не разжижает, клетчатку не использует. Растет на средах с углеводами, подщелачивая среду. Активно использует глюкозу, лактозу,мальтозу, сорбит, сахарозу, слабее - маннит, очень слабо - ксилозу. Растет на средах с аммонийными солями,азотнокислым калием. Признаки штамма устойчивы. Он не патогенен. Пересевается 1 раз в 6 месяцев и хранится на среде с бобовым отваром при 4-5 С. Штамм Г-2 идентифицирован по Определителю Берги (2009) как штамм вида. Изобретение поясняется следующими примерами. Пример 1 Проведен подбор оптимальной среды для роста штаммаГ-2. Результаты опытов приведены в табл. 1. ШтаммГ-2 инкубировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 200 мл среды в течении 48 часов на орбитальном шейкере при 180200 об/мин и температуре 281 С. Оптимальной для роста штамма Г-2 является среда с бобовым отваром, на которой титр клеток достигает 1,60,22109 КОЕ/мл. Наиболее высокий титр клеток (3,20,261010 КОЕ/мл) наблюдается на этой среде при использовании сахарозы в концентрации 10,0 г/л (табл. 2). Разработан оптимальный вариант модифицированной среды с бобовым отваром для роста и максимального накопления биомассы штамма клубеньковых бактерий гороха(титр клеток 3,60,211010 КОЕ/мл). Результаты опытов приведены в табл. 2. Состав модифицированной среды с бобовым отваром, г/л КН 2 РО 4 - 1,0 О 472 О - 0,3 СаСО 3 - 4,0 сахароза -10,0 горох - 50,07,0. Пример 2 Конкурентоспособность штамма Г-2 определяли методом генетического маркирования. Исследуемый штаммГ-2 культивировали на минерально-растительной среде(МРС) с возрастающими (от 20 до 1000 ед/мл) дозами антибиотика (стрептомицина или канамицина). Полученные резистентные варианты использовали для проведения вегетационных исследований. На каждый вариант вегетационного опыта сеяли по 100 штук семян. Для исследования использовали сорт гороха Аксайский усатый-55. Перед инокуляцией семена стерилизовали смесью этанола и перекиси водорода (11) и промывали трехкратно стерильной водой. Клубеньки, взятые с корней бобовых растений, в возрасте не менее 5 недель,стерилизовали и помещали в стерильную чашку Петри с водой. В стерильные чашки Петри предварительно разливали среду МРС (минеральнорастительная среда) без антибиотика и, отдельно,такую же среду, но с 1000 ед. стрептомицина на мл среды. Состав среды МРС, (г/л) К 2 НРО 4 - 0,5 КН 2 РО 4 - 0,5 О 472 - 0,1 О 4 - 0,10,2 (Н 4)6 Мо 7244 Н 2 - следы маннит или глюкоза - 20,0 соевая мука - 10,06,8-7,0. На 2 чашки Петри со стрептомицином (1000 ед/мл) и 1 чашку без антибиотика (контроль) стерильно пинцетом размещали клубеньки и раздавливали,делая поверхностный мазок. Предварительно под чашки Петри подкладывали расчерченные шаблоны на 25 гнезд. Итого на одной чашке анализировали 25 клубеньков. Инкубирование исследуемых чашек проводили в течение 7-10 дней. С одного варианта анализировали по 50 клубеньков. После этого подсчитывали количество клубеньков, давших рост клубеньковых бактерий на обычной среде и среде со стрептомицином. Результаты рассчитывали по формуле 100/0. Величину конкурентной способности выражали в процентах. Результаты опытов приведены в табл. 4. Конкурентная способность штаммаГ-2 равна 37,5. Пример 3 Азотфиксирующую активность штаммаГ-2 изучали ацетиленовым методом. Клубеньковые бактерии выращивали на агаровой среде следующего состава, (г/л) КН 2 Р 4 - 1,0 472 - 0,3 сахароза - 2,0 бобовый отвар 50,07,0. Микроорганизмы выращивали в закрытых ватными пробками флаконах. Для инициации роста добавляли минимальное количество источника связанного азота (0,00010,005 дрожжевого экстракта). В конце инкубационного периода ватную пробку заменяли стерильной пенициллиновой пробкой. Газообразный ацетилен собирали в вытяжном шкафу следующим образом. В пробирку, наполовину заполненную 15 мл воды, добавляли небольшое количество(около 1 г) карбида кальция. Пробирку закрывали пробкой с отверстием, через которое она с помощью резиновой трубки соединялась с химическим стаканом с водой. Ацетилен вводили в сосуд с культурой через резиновую пробку до концентрации 10 (по объему). Через различные промежутки времени инкубации отбирали пробы газа по 1 мл из сосуда с культурой и проверяли наличие этилена методом газовой хроматографии. Азотфиксирующую активность определяли по восстановлению ацетилена в этилен методом газовой хроматографии на хроматографе марки 7697 А. Величину нитрогеназной активности выражали в нмоль С 2 Н 4/ч/ 1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Результаты опытов приведены в табл. 4. Азотфиксирующая активность составляет 13,5 нмоль 24/ч/1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Всхожесть гороха на опытных участках в Восточно-Казахстанской области при использованииГ-2 отмечена на 2 дня раньше, фаза ветвления на 3 дня,цветение на 2 дня, бутонизация на 2 дня и плодообразование на 5 дней раньше фенологических фаз в контрольном варианте. Также показано увеличение урожайности на 0,8-1,3 ц/га. При инокуляции семян гороха биопрепаратами серии Ризовит АКС высота растений увеличивается на 27,1-52,7, накопление зеленой массы растений на 12,3-25,6, количество клубеньков на 33,3-53,5 для одного растения. Таким образом, штаммГ-2 может быть использован для получения бактериального препарата под горох,адаптированного для почв Казахстана. Штамм проявляет высокий уровень роста на модифицированной среде с бобовым отваром,активно фиксирует атмосферный азот, обладает высокой конкурентной способностью и проявляет эффективность в полевых экспериментах. Таблица 1 Подбор оптимальной среды для роста и накопления биомассы штаммаГ 2 Питательные среды Исварана Лазарева Среда с бобовым отваром Среда с кукурузным экстрактом Грэхема Фреда Норриса МРС Мазэ МиниМальная среда Морфологические признаки колоний Полупрозрачные,приподнятые,слизистые, округлые с ровными краями диаметр колоний 0,2-0,5 см Таблица 2 Влияние источников углерода на рост и накопление биомассы штаммаГ 2 Углеводы 1 Сахароза Морфологические признаки колоний 4 Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями, диаметр колоний 0,3-0,6 см Таблица 3 Оптимизация состава среды с бобовым отваром для накопления биомассы штаммаГ-2 Г-2 Контроль отваром) Прозрачные, выпуклые, округлые с ровными краями диаметр колоний 0,1-0,3 см Прозрачные, выпуклые, округлые с ровными краями диаметр колоний 0,1 см Таблица 4 Азотфиксирующая активность и конкурентная способность штаммаГ-2 Штаммы клубеньковых бактерий Азотфиксирующая активность, нмоль Конкурентная способность,С 2 Н 4/ч/ 1 млн. клеток клубеньковых бактерийГ-2 13,50,21 37,50,22 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм клубеньковых бактерий.Г-2, депонированный в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК под регистрационным номером ИМиВ В-23, используемый для получения бактериального препарата под горох.