Способ культивирования фибробластов человека на подложке из ксеногенной брюшины

(51) 12 5/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 0300 от 28.11/2010),можно использовать аутологичные фибробласты. Для культивирования применяют среду ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов крупного рогатого скота (10 сыворотка, 90 -ДМЕМ, рН среды роста 7,2-7,4). Подготовленную взвесь клеток высевают на поверхность брюшины, помещают в термостат и культивируют при температуре 37 С и 5 С 2. Полученное раневое покрытие используют после наращивания клеток в течение 48-72 ч. Трансплантат используют в течение 5-6 часов после образования монослоя, либо хранят при температуре 4-6 С в течение суток. Способ обеспечивает получение трансплантата,обладающего высокой эффективностью. Достоверность полученных результатов подтверждена гистологически и цитологически при изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином. Полученные результаты свидетельствуют о возможности и перспективности использования культивированных фибробластов кожи на подложке из ксеногенной брюшины в качестве временного покрытия при глубоких и обширных ожогах при недостатке донорского материала для предотвращения инфицирования и ускорения процесса заживления ран.(72) Абугалиев Кабылбек Ризабекович Данлыбаева Газиза Аятбековна(73) Акционерное общество Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА НА ПОДЛОЖКЕ ИЗ КСЕНОГЕННОЙ БРЮШИНЫ(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии, экспериментальной и клинической медицине, трансплантологии и комбустиологии, и направлено на получение раневого покрытия с использованием живых культивированных клеток кожи, в частности фибробластов, для лечения ожогов и поверхностных ран. Технической задачей изобретения является разработка способа культивирования фибробластов на ксеногенной брюшине крупного рогатого скота. В качестве культуры фибробластов используют штамм диплоидных клеток кожи эмбриона человека ФЭЧ 2/09 ( свидетельство о депонировании 26959 Изобретение относится к медицинской биотехнологии, экспериментальной и клинической медицине, комбустиологии, трансплантологии,может быть использовано для восстановления полнослойных кожных дефектов различной площади и глубины, и направлено на получение раневого покрытия с использованием живых культивированных клеток кожи, в частности,фибробластов, для лечения ожогов и поверхностных ран. Фибробласто - и эпителиоподобные клеточные линии (фибробласты, кератиноциты) относятся к монослойным культурам,жизнеспособность которых зависит от субстрата . Для пролиферации и дальнейшего роста, им необходимо прикрепиться к поверхности. При культивировании в лабораторной посуде происходит прикрепление клеточной массы к поверхности сосуда. Более перспективным и удобным для трансплантации является культивирование клеток кожи на носителе(подложке),вместе с которым клеточные трансплантаты пересаживаются на раневую поверхность. Проблемным моментом является то, что клеточные культуры высоко избирательны к носителям и не дают роста на многих синтетических или биологических подложках. Известен способ культивирования аллогенных фибробластов на чашках Петри или специальных флаконах с последующей трансплантацией на ожоговые раны. Институт хирургии им. А.В.Вишневского, Федоров В. Д. и др.93002420/14 от 13.01.1993 публ.30.11.1994. Механизм действия предложенного метода заключается в синтезе аллогенными фибробластами белков экстрацеллюлярного матрикса, факторов роста,стимуляции пролиферации собственного эпителия,направленных на восстановление как эпидермального, так и дермального компонента кожи. Недостатком данного способа является необходимость ферментативной обработки для снятия слоя фибробластов от поверхности культурального сосуда. Для этого проводится обработка ферментамидиспазой, трипсином и др. При этом происходит разрушение межклеточных связей, что приводит к повреждению клеток и снижению жизнеспособности клеточных культур. Трансплантация клеток проводится в виде клеточной взвеси. Во время операции трансплантация жидкой клеточной культуры доставляет неудобства при нанесении на рану(стекание, впитывание в повязки, недостаточный визуальный контроль, неравномерность нанесения). Для исключения этапа ферментативной обработки перспективным и более удобным способом является культивирование и трансплантация клеток, выращенныхна поверхности пленки (на которой они до этого культивировались) или же в виде дермального эквивалента. Известны способы выращивания слоя клеточных культур на поверхности коллагенового и фибринового геля .- 1991, Н.1994, . Корр - 1995. После формирования пластов гель с клетками переносится на раневую поверхность. Н. трансплантировал аутологичные кератиноциты, выращенные на поверхности фибринового матрикса и поверх них накладывали расщепленные лоскуты аллокожи,консервированной в глицерине. Недостатком этих способов является дороговизна фибриновой и коллагенового гелей,неспособность клеток распластываться и расти в геле, трудность использования в широкой клинической практике. Известен также способ восстановления кожного покрова,включающий выращивание в искусственных условиях многослойных пластов кератиноцитов на поверхности культурального флакона, при этом для клеточного пласта ростовую среду добавляют в фермент диспазу и пересадку клеточной культуры на раневую поверхность осуществляют на поверхности парафинизированной марли см.Н.,О. , . -. // . . . . . - 1979. . 76. - . 5665-5668. Недостатки способов. Он весьма сложен в осуществлении, так как состоит из большого числа этапов. Отличает высокая стоимость, которая складывается из затрат на большое количество одноразовой культуральной посуды,изготавливаемой из специальных видов пластика, а также из стоимости сред, сыворотки, ростовых факторов, ферментов. Имеется способ восстановления кожного покрова, включающий выделение кератиноцитов, а затем культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке в виде пластины толщиной 4-6 мм с размерами пор 10-30 мкм с последующей пересадкой находящейся на пористой пластине выросшей клеточной культуры кератиноцитов на раневую поверхность наложением пластины в положении клеток, обращенных в раневой поверхности см. патент РФ 2014359 по кл. С 12 5/00, опубл. 15.06.94 г Известный способ позволяет стимулировать пролиферацию, миграцию и функционирование кератиноцитов, при этом пористая структура полимерной пластины позволяет включать и длительно удерживать в порах растворы разнообразных цитокинов. Недостатки данного способа являются сложным и многоэтапным, а, следовательно, и длительным,так как предусматривает предварительное формирование на полимерной пластине биоактивной поверхности из межклеточного матрикса. В случае неровной раневой поверхности происходит неплотное прилегание к ней всей поверхности пластины со слоем кератиноцитов, в результате чего клетки неравномерно распределяются по ожоговой поверхности. Из-за непрозрачности пористой полимерной пластины отсутствует возможность визуального контроля за состоянием раны. Все это снижает эффективность применения способа. Известны случаи применения для лечения ожогов таких пленок, как Биокол Алейник Д. Я.,Аминев В.А., Чарыкова И.Н., Кувакина Н.А. Использование современных биотехнологий для лечения поверхностных ожогов у детей младшего возраста // МатериалыМеждународного симпозиума Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи. Саратов, 1998, с.6-8 и Карбоксил-П патент 02373944, от 23.06.2008, опубл. 27.11.2009, МПК А 61 К 33/00. Парамонов Б.А. и др. культивировали фибробласты и кератиноциты на синтетической плнке Фолидерм, на поверхности которой хорошо пролиферируют клетки кожи, а также на подложках из полиэтилентерефталата, полиимида,карбоксиметилцеллюлозы и других подобных по своим физико-механическим, а также биоафинным свойствам химически инертных полимерных материалов. При пересадке на рану прикладывался слой с культивированными клетками к ране, а плнка оказывалась на поверхности раны и выполняла защиту пересаженных клеток от высыхания Патент 2148970 С 1,опубл.20.05.2000, Парамонов Б.А., ПорембскийО.Я.,Яблонский В.Г. Ожоги. Руководство для врачей. Известен способ восстановления кожного покрова при обширных ожогах, включающий выделение и культивирование кератиноцитов на коллагеновых микроносителях в течение 1-7 дней,после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами наносят на раневую поверхность см. патент РФ 2010028 по кл. С 12 5/00, опубликован 30.04.94 г Такой способ позволяет повысить эффективность культивирования кератиноцитов,однако,для его реализации специальное оборудование (роллерные и другие биотехнические установки) и определенные виды микроносителей типа Цитолар или Цитопол. Кроме того, при трансплантаций выращенных кератиноцитов трудно достичь равномерного распределения микроносителей с прикрепленными к их поверхности клетками по раневой поверхности. Известен способ культивирования фибробластов и кератиноцитов и получения композиционного эквивалента живой кожи,разработанный М.Эйсенбергом ,91/160100 от 31.10.91,опубл.27.08.1999. При данном методе, аллогенные или аутологичные фибробласты инокулируют в пористую перекрестно сшитую бычью коллагеновую губку, после образования на мембране колоний фибробластов, ее другую сторону обрабатывают беспористым бычьим коллагеном 1 типа. После повторной инкубации беспористый бычий коллаген инокулируют культурой кератиноцитов,проводят культивирование в питательной среде с добавлением эпидермального фактора роста,инсулина и гидрокортизона. Был также описан каркас, состоящий из синтетических полимеров и предназначенный для регулирования клеточного роста и пролиферациитак, чтобы после начала роста фибробластов и присоединения их к матриксу, их можно было трансплантировать пациенту (., патенты США 5759830 5770193 5736372). Недостатком всех вышеперечисленных известных способов культивирования клеток кожи является малодоступность и дороговизна плнок,отсутствие свойства биодеградации синтетической основы плнок. Вследствие этого существует необходимость удаления плнки из-за чего происходят повреждения,как культуры трансплантированных клеток, так и вновь образующихся собственных клеток кожи. В ряде случаев плнка может изолировать рану и вследствие этого увеличивается риск нагноения. Одними из вариантов закрытия поверхностных ожоговых ран являются биодеградируемые натуральные материалы, такие как аллогенная кожа кадавера и амниотическая мембрана новорожденных. При проведении первых исследований по культивированию эпителиальных клеток в качестве подложки использовалась амниотическая мембрана,. -2000- .343- Р.86-93. Полученные на е основе биотрансплантаты были с успехом использованы для ауто - и аллотрансплантации у пациентов.,С.Е.,А.Т.. 1997- .349.- .990-993,2004 . Высокие результаты данной технологии позволили ей утвердиться как одной из самых эффективных при лечении эпителиальной патологии роговицы, так и аллогенной кожи для лечения ожогов,,,... - 2002- - 4- . 185-190. Однако при использовании этих материалов есть трудности их получения и хранения, существует риск отторжения эпидермиса и передачи заболеваний. Задачей заявляемого изобретения являлась разработка такого способа восстановления кожного покрова, который можно использовать в качестве доступного, эффективного и дешевого временного покрытия при обширных и глубоких ожоговых поражениях кожи. Преимуществом ксеногенной брюшины является дешевизна,доступность,гигроскопичность,бактерицидность, эластичность, устойчивость к механическому воздействию,биодеградация. Подложка обеспечивают высокую степень адгезии культивируемых клеток к ее поверхности и выполняет защиту пересаженных клеток от высыхания, а выделяемые растущими клетками компоненты внеклеточного матрикса, ростовые факторы и цитокины способствуют стимуляции роста собственных клеток дермы и эпидермиса. Авторам из научно-технической, в том числе патентной литературы не известна совокупность признаков заявляемого технического решения, что,3 по мнению авторов, свидетельствует о соответствии заявляемого способа критерию новизна.Отличительные признаки заявляемого технического решения обеспечивают достижение нового технического результата - повышение эффективности способа восстановления кожного покрова и существенное снижение стоимости при одновременной возможности биосовместимости и биодеградации используемой естественной подложки,что соответствует критерию изобретательский уровень. Технической задачей изобретения является разработка способа культивирования аллогенных или аутологичных фибробластов на ксеногенной брюшине. Трансплантаты, полученные данным способом с использованием культуры фибробластов человека при хирургическом лечении ожоговых ран,эффективны. Клиническая эффективность применения клеточной культуры проявляется за счет неспецифической стимуляции репарации эпителия, в основном, за счет выделения в раневую поверхность факторов роста, цитокинов и молекул межклеточного матрикса, ускоряющих заживление как ожоговых, так и донорских ран. Поставленная задача решается тем, что в способе культивирования клеток кожи, включающем выделение и культивирование фибробластов(аллогенных или аутологичных) на ксеногенной подложке из брюшины крупного рогатого скота с последующей пересадкой их на раневую поверхность, клетки культивируют на подложке до формирования монослоя и трансплантируют культивированными клетками к раневой поверхности (головой вниз). Изобретение осуществляется следующим образом. 1 этап. Фибробласты по принятым технологиям. На первом этапе получают культуру фибробластов человека путем фрагментации и ферментативной обработки дермы эмбриона или взрослого человека. Кожно-мышечную ткань с соблюдением правил асептики механически очищают от мелких кровеносных сосудов, промывают в растворе Хенкса с добавлением антибиотиков, измельчают и помещают в теплую смесь 0,25-ного раствора трипсина и 0,02 раствора Версена в соотношении 11 при температуре 37 С на 30 минут. Проводят 3 цикла дезагрегации со сменой среды, полученную взвесь, фильтруют и центрифугируют, осадок ресуспендируют в питательной среде ДМЕМ. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток в камере Горяева. Суспензию клеток разводят до концентрации 3-4105 клеток в 1 мл питательной средой ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов коровы и переносят во флаконы для культивирования. Клетки культивируют при температуре 37 С и в атмосфере 5 СО 2, через сутки после посева проводят смену среды. Дальнейшее субкультивирование проводят на 3-4 сутки с коэффициентом разведения суспензии 12 в фазе активного роста. После стабилизации культуральных свойств через 4-5 последовательных пассажей суспензию культуры клеток или 4 культуральную жидкость исследуют на микробиологическую стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов. При отсутствии контаминации культуру клеток накапливают в процессе культивирования и на 5-ом пассаже замораживают. 2 этап. Из матрасов с выросшим монослоем (9095 поверхности) удаляют питательную среду ДМЕМ, вносят в них подогретую до 37 С смесь раствора Версена (0,02) и трипсина (0,25) в количестве, достаточном для покрытия клеточного монослоя и помещают в термостат при 37 на 3-5 мин. После округления клеток в результате действия трипсин-Версена их разбавляют необходимым количеством среды ДМЕМ и слегка пипетируют для перевода клеток в суспензию. Суспензию клеток разводят до концентрации 1,5-2105 клеток в 1 мл питательной средой ДМЕМ. 3 этап. Брюшина крупного рогатого скота была получена нами в транспортной среде (-1640 с антибиотиками - Цефи флуканолом). Поскольку брюшина - это многослойная структура, для применения при культивировании она была расслоена. Затем брюшину, очищенную от жира и расслоенную, в асептических условиях промывают несколько раз раствором Хэнкса с антибиотиками(пенициллин, стрептомицин, флуканол в количестве по 500 Ед/мл) и выдерживают сутки в растворе Хэнкса с антибиотиками в холодильнике при 4 С в чашке Петри. После чего раствор слили и подготовленную суспензию фибробластов в концентрации 2,0105 клеток/мл нанесли на поверхность брюшины, находящейся в чашке Петри. Контролем служили клетки, посеянные на обычную чашку Петри. На подложках из брюшины начинает формироваться клеточный монослой,причем клетки культивируют в среде ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов. На 5 сутки контрольные и опытные клетки были сняты смесью трипсин/Версена и подсчитан индекс пролиферации, который был равен 2,0, что сопоставимо с таковым в контроле (2,75). В дальнейшем, было проведено гистологическое исследование, в результате которого были выявлены культуральные фибробласты, расположенные в виде тонкого пласта,свободно лежащие на соединительно-тканной основе брюшины (фиг.1). На отдельных участках микропрепарата видна тонкая гомогенная основа,являющаяся внеклеточным матриксом культуральных клеток. Фиг.1 - Гистологический срез брюшины КРС пласт культуральных клеток плотно прилежащих друг к другу. А - увеличение 100, В -увеличение Х 400. Окраска гематоксилином и эозином. Проведение цитологических исследований показало, что культуральные клетки имели крупные размеры,базофильно окрашенные ядра и оксифильно окрашенную цитоплазму и плотно прилегали друг другу, что в последующем исследовании было подтверждено при получении мазков-отпечатков с поверхности брюшины (фиг.2). Фиг.2 - Культивированные фибробласты на гомогенной основе брюшины копление крупных клеток с розово-сиреневыми ядрами и узким ободком цитоплазмы зеленоватого цвета. А однослойное скопление клеток, В - клетки с наложением (увеличение Х 1000). Материал окрашивают по методу Папаниколау,при котором ядра окрашиваются в розоватосиреневый цвет, а цитоплазма - в зеленоватый цвет. При светло-оптическом исследовании цитологического материала при иммерсии х 1000 было выявлено, что материал представлен крупными клетками овальной формы с большим ядром и узким ободком цитоплазмы с чткими границами. Клетки располагались однослойно или накладывались друг на друга. Полученные результаты свидетельствуют о возможности культивирования фибробластов человека на ксеногенной брюшине с целью дальнейшего использования при лечении обширных и глубоких ожогов при недостатке донорского материала. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ культивирования фибробластов человека на подложке из ксеногенной брюшины,включающий выделение фибробластов, их рассев и культивирование на поверхности, отличающийся тем, что для приготовления подложки используют ксеногенную брюшину крупного рогатого скота.