Способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 01 33/577 (2010.01) 01 33/569 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Технической задачей изобретения является разработка способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота,повышающего специфичность ИФА при лабораторной диагностике трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что на поверхности лунок полистиролового планшета для иммунологических реакций последовательно сенсибилизированы моноклональные антитела класса,специфичные к белку клеточной стенки возбудителя трихофитии крупного рогатого скотас молекулярной массой 30 кДа, и белковый антиген, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену антител, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови,величина оптической плотности которых в 2 и более раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. Предложенный способ диагностики трихофитии обеспечивает повышение специфичности ИФА при диагностики трихофитии крупного рогатого скота.(72) Кухар Елена Владимировна Киян Владимир Сергеевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Боровиков Сергей Николаевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Кухар Е.В. Антигенные свойства компонентов клеточной стенки возбудителя трихофитии и их использование в разработке иммуноферментной тест-системы. Вестник науки Казахского аграрного университета им. С.Сейфуллина, Астана, 2002, с.75,79.,(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. 24954 Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Известен ряд традиционных способов диагностики трихофитии крупного рогатого скота,основанных на выявлении в сыворотке крови животных антител, специфичных к возбудителю болезни, с помощью реакции диффузионной преципитации (РДП) Аспанидзе А.Н. Апробация методов извлечения антигенных комплексов из различных трихофитонов для изучения антигенных связей в РДП // Бюлл. ВИЭВ. Москва. 1984. Вып. 54. с. 44-45, реакции коагглютинации (РКОА) Маноян М.Г. Антигенные и иммуногенные связи возбудителей трихофитии парнокопытных. Автореф. диссканд. вет. наук. Москва. 1991,реакции микроагглютинации (РМА) Кухар Е.В. Реакция микроагглютинации в диагностике трихофитии крупного рогатого скота. // Вестник СемГУ им. Шакарима.3. 2002 г. с. 102-109. К общим недостаткам приведенных способов диагностики трихофитии, относится их низкая чувствительность. Известен способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота,включающий использование в качестве твердой фазы полистироловых планшет, сенсибилизированных полисахаридным антигеном гриба Антигенные свойства компонентов клеточной стенки возбудителя трихофитии и их использование в разработке иммуноферментной тест-системы. Автореф. дисс канд. вет. наук. Астана. 2001. с. 3-20 Однако и этот способ не лишен недостатков. Полисахаридные компоненты клеточной стенки гриба, применяемые в данных тестах, на своей поверхности,наряду со специфичными детерминантами, содержат антигены, родственные с другими дерматофитами рода , что снижает не только чувствительность, но и специфичность ИФА. Технической задачей изобретения является разработка способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота,повышающего специфичность ИФА при лабораторной диагностике трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что на поверхности лунок полистиролового планшета для иммунологических реакций последовательно сенсибилизированы моноклональные антитела класса,специфичные к белку клеточной стенки возбудителя трихофитии крупного рогатого скотас молекулярной массой 30 кДа, и белковый антиген, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену антител, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови,величина оптической плотности которых в 2 и более раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. 2 Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Готовят препаративное количество моноклональных антител. С этой целью ампулу с замороженными гибридными клетками вынимают из сосуда (СДС-30-1) с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды (4 С), отмывают один раз путем центрифугирования 5-7 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок клеток ресуспендируют в неполной ростовой среде,нагретой до комнатной температуры, и вводят в дозе 2106 клеток внутрибрюшинно мышам линии/, которым за 7-10 дней до введения гибридомы инъецируют пристан(2,6,10,14 тетраметилпентадекан) в дозе 0,5 мл на голову. После образования асцитной опухоли через 12-14 дней мышь забивают цервикальной дислокацией,фиксируют на подложке и препарируют кожу вдоль белой линии живота. Асцитную жидкость из брюшной полости собирают в центрифужные пробирки с помощью стерильного шприца с иглой. Затем асцитную жидкость центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут для отделения гибридных клеток. Надосадочную жидкость,содержащую моноклональные антитела, с помощью пипетки отбирают в отдельную посуду. Очистку моноклональных антител из асцитной жидкости осуществляют методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого асцитную жидкость сначала разбавляют равным объемом забуференного физиологического раствора (ЗФР,рН 7,2), добавляют равный объем (/) насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при постоянном перемешивании 12 часов на магнитной мешалке при температуре 4 С. Антитела отделяют путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 30 минут при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР с рН 7,2, переносят в диализную трубку и диализуют против ЗФР в течение 24 часов. Определяют концентрацию МКА в растворе по белку методом Бредфорда. Очищенные моноклональные антитела в виде раствора хранят при 4 С с добавлением 0,1 азида натрия или в замороженном состоянии при-70 С без консерванта. Пример 2. Готовят конъюгат - комплекс,состоящий из кроличьих антител противкрупного рогатого скота и фермента пероксидазы хрена. С этой целью 4 мг пероксидазы хрена ( 2.7-3.0) растворяют в 1 мл дистиллированной воды,прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0, 1 М раствора перийодата натрия и осторожно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре. Приготовленный раствор фермента диализуют против 0,001 М ацетатного буфера(рН 4,4) в течение 18 часов при температуре 4 С. Затем в полученный альдегидный раствор пероксидазы вносят 0,02 мл 0,2 М бикарбонатного 24954 буфера (рН 9,5) и сразу же прибавляют 8 мг аффинных антител (антител ккрупного рогатого скота) в 0,01 М бикарбонатном буфере (рН 9,5). Реакционную смесь выдерживают 2 ч в темноте при температуре 20 С, добавляют к ней 0,1 мл свежеприготовленного раствора боргидрата натрия и оставляют на 2 часа при 4 С. Затем диализуют против боратного буфера (16-18 часов, 4 С),прибавляют равный объем 60 глицерина в боратном буфере и хранят при 4 С. Определяют рабочий титр конъюгата методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение, которое выявляеткрупного рогатого скота в концентрации не ниже 20-40 нг/мл. Конъюгат считается пригодным для использования,если имеет рабочий титр не менее 1500. Пример 3. Определение оптимальных параметров постановки сэндвич варианта ИФА для выявления противотрихофитийных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. С этой целью на поверхность полистиролового планшета последовательно сенсибилизированы МКА и белковый антиген против трихофитии. В лунки полистиролового планшета для иммунологических реакций вносят по 0,1 мл раствора моноклональных антител в концентрации 0,1 мг/мл в ЗФР с рН 7,4. Для адсорбции антигена планшет закрывают крышкой, инкубируют при 4 С в течение 18 часов. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и отмывают трехкратно по 1-2 мин,заполняя лунки до верхнего края ЗФР с 0,05 твином 20 (ЗФР-Т). В лунки планшета для блокирования свободных участков вносят по 0,1 мл 1 растворбычьего сывороточного альбумина и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. После инкубации повторяют процедуру отмывки. Затем вносят белковый антиген в концентрации 0,1 мг/мл,планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. Повторяют процедуру отмывки. Готовят разведения 1400 контрольных(позитивной и отрицательной) и испытуемой сыворотки в ЗФР-ТВ. Для этого в первый ряд чистых пробирок вносят по 0,45 мл, во второй 0,45 мл и в третий по 0,25 мл ЗФР-ТВ. После этого в первый ряд вносят по 0,05 мл испытуемых и контрольных (К и К-) сывороток, тщательно перемешивают и переносят по 0,05 мл во второй ряд, тщательно перемешивают и переносят 0,1 м в третий ряд. В третьем ряду пробирок получают разведение 1400. В 2 лунки планшета А-1 и В-1 вносят по 0,1 мл разведенной 1400 контрольной позитивной сыворотки, в 2 лунки С-1 и-1 вносят по 0,1 мл контрольной негативной сыворотки, в 2 лунки Е-1(контроль конъюгата) и-1 (контроль субстрата) вносят по 0,1 мл раствора ЗФР-ТВ. В остальные лунки планшета вносят по 0,1 мл исследуемых сывороток в разведении 1400 в двух повторах, т.е. каждую пробу вносят в 2 лунки (всего 45 проб на одну планшету). Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 С. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют, и отмывают вышеописанным способом Во все лунки планшета, кроме лунок -1 и Н-1, вносят по 0,1 мл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 С. По истечении времени инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки и во все лунки планшета вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением в 10 мл 0,05 М фосфатноцитратного буфера (рН 5,0) растворяют 0,01 г ортофенилендиамина и вносят 0,05 мл 33-36-ной перекиси водорода. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в темном месте при комнатной температуре (222 С) в течение 30 мин. Реакцию останавливают после развития желтого окрашивания в лунках с положительным контролем путем внесения в каждую лунку планшета по 0,1 мл 2 М раствора серной кислоты. Остановка реакции характеризуется темно-коричневым окрашиванием субстратной смеси в лунках контрольных позитивных проб. Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной негативной сывороткой (К-), контролей конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой (К) не менее 0,5 о.е. Учет проводят путем измерения оптической плотности реакционной жидкости в лунках планшета на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Результаты анализа сывороток крови крупного рогатого скота на трихофитию считают положительными, если среднее значение ОП исследуемого образца сыворотки (Р) превышает среднее значение ОП контрольной отрицательной сывороткив 2 и более раза (/). Пример 4. Чувствительность сэндвич варианта твердофазного иммуноферментного анализа изучают с сыворотками крови телят,иммунизированных вакциной ЛТФ-130. Тестирование сывороток крови телят показало наличие высокий значений титров антител,выявляемых предложенным способом. При этом показатели оптической плотности (ОП) при спектрометрическом учете результатов реакции имеют высокие значения как в разведении 1200, так и в разведениях 1400 и 1800. Это говорит о высокой чувствительности сэндвич варианта ИФА и делает возможным использование МКА в разведении 1400 при разработке тест-систем для выявления противотрихофитийных антител (таблица 1). 24954 Таблица 1 Показатели экстинции противотрихофитийных антител в сыворотках крови крупного рогатого скота в сэндвич варианте ИФАпроб Средние значения ОП сывороток крови при длине волны 492 нм 1200/ 5 1,172 9,02 0,992 7,63 0,911 7,01 0,833 6,41 7 1,088 8,37 0,877 6,75 0,787 6,05 0,706 5,43 9 0,990 7,62 0,686 5,27 0,667 5,13 0,483 3,71 12 0,932 7,17 0,722 5,55 0,656 5,05 0,534 4,10 1 0,906 6,97 0,467 3,59 0,324 2,49 0,296 2,28 13 0,610 4,69 0,423 3,25 0,408 3,14 0,332 2,55 8 0,434 3,34 0,399 3,07 0,387 2,98 0,273 2,1 10 0,450 3,46 0,367 2,82 0,300 2,31 0,252 1,94 17 0,518 3,95 0,338 2,60 0,281 2,16 0,247 1,9 15 0,417 3,2 0,288 2,22 0,263 2,02 0,246 1,89 К (- ) 0,145 0,142 0,136 0,096 Примечание / отношение ОП испытуемой сыворотки к ОП контрольной отрицательной сыворотки К(-) - контрольная отрицательная сыворотка-среднее значение К(-). Как видно из таблицы 1, у шести животных показатели экстинции реакционной жидкости позитивных лунок превышали таковые у контрольных в 2,5 раза и более, даже в разведении 11600. Это означает, что результаты предлагаемого способа можно учитывать и визуально, т.е. без помощи дорогостоящего считывающего устройства. Пример 5. Специфичность предложенного способа определяли в сравнении с непрямым ИФА,постановка которого осуществляется на основе поликлональных антител (ПКА). При постановке сэндвич варианта ИФА основывались на взаимодействии сывороточных трихофитийных антител с последовательно сенсибилизированными МКА и белковым антигеном против трихофитии крупного рогатого скота на поверхности лунок полистиролового планшета с последующим выявлением их с помощью конъюгата(антивидовых антител меченных пероксидазой хрена). Результаты сэндвич варианта ИФА сравнивали с непрямым вариантом иммуноферментного анализа (таблица 2). Таблица 2 Сравнительный анализ данных различных вариантов ИФА М, при р Наименование районов Аулиекольский район Тарановский район Всего Непрямой ИФА Из них положи тельных 293 406 699 Полученные данные свидетельствуют о том,что сэндвич вариант ИФА более специфичен и чувствителен, чем непрямой вариант. Всего было исследовано 705 проб сывороток КРС, из которых в непрямом варианте ИФА выявлено 699 положительно реагирующих, что составило 99 от общего количества проб. Сэндвич вариантом ИФА из того же количества проб вы явила 488 положительно реагирующих (69). Таким образом,из общего числа животных, у которых выявлены антитела к возбудителю трихофитии,исключены ложноположительные результаты. Пример 6. Диагностическую ценность предложенного способа диагностики трихофитии Сэндвич ИФА Из них положи Средний титр тельных 245 36260,2 243 37149 488 36754,6 крупного рогатого скота оценивают в сравнении с общеизвестными способами реакцией агглютинации в микроварианте (РМА) и непрямом варианте ИФА, сущность которого заключается во взаимодействии клеточных компонентов гриба с исследуемыми сыворотками. Активность и специфичность сэндвич варианта ИФА с использованием МКА при выявлении специфичных противотрихофитийных антител изучена на 736 пробах сывороток крови крупного рогатого скота. Результаты исследований по отработке различных вариантов ИФА показаны в таблице 3. 24954 Таблица 3 Показатели титров противотрихофитийных антител в сыворотках крови крупного рогатого скота Наименование хозяйства Количество Показатели титров антител (/) проб РМА Непрямой ИФА ТОО Азия Алтын 2000 428 АФ Родина 210 12/1256 Вет. клиника (Учхоз) 10 14/164 с. Интернациональное 8 14/1256 АО Жангиз-Кудук 30 14/1256 с. Куралай, СКО 50 К 3 1256 К 3 отр./12 Средний титр 132 выявления 66,7 Примечание - - - исследование не проводилось Как видно из таблицы 3, иммуноферментный анализ позволяет выявить больший процент животных, содержащих специфические антитела в сыворотках крови, в сравнении с общепринятым серологическим тестом, каковым является реакция агглютинации. Процент выявления специфических антител в сыворотках крови животных при наличии клинических признаков трихофитии составляет в ИФА с использованием МКА до 93,8. Таким образом, использование МКА в ИФА позволило повысить эффективность выявления специфических антител против трихофитии в сыворотках крови крупного рогатого скота при серологической диагностике трихофитии на 27,1 в сравнении с РМА, и на 6,3 в сравнении с непрямым ИФА, где использовали поликлональные антитела. Это говорит о высокой специфической активности компонентов реакции и возможности ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий последовательную сенсибилизацию полистироловой планшеты моноклональными антителами и белковым антигеном с последующим выявлением в сыворотках крови специфичных к возбудителю болезни антител с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов, отлчающийся тем, что в качестве сенсибилизирующего агента используют моноклональны е антитела класса ,специфичные к белковому антигену грибас молекулярной массой 30 кДа.