Способ получения поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят

(51) 61 39/116 (2006.01) 61 39/08 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Задачей изобретения является снижение себестоимости способа, повышение эффективности вакцины, ее защитных и иммуногенных свойств, создание у животных высокого антитоксического иммунитета. Способ изготовления поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии,злокачественного отека овец и дизентерии ягнят,включающий культивирование штаммов,итипов В, С и Д на жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, гидролизат гороха и сои, печеночный экстракт, гидролизат казеина, пептон, сухой дрожжевой экстракт, натрий хлористый, твин 80, однозамещенный фосфатнокислый калий, двузамещенный фосфатно-кислый натрий, глюкоза, -аргинин, пропионол Б-400, кальций хлористый, магний сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислая, железо сернокислое, обработку формалином, концентрирование, составление серии смешиванием анакультур, обогащение их анатоксином клостридий,итипов В, С и Д, расфасовку вакцины. Преимуществом предлагаемого способа является снижение себестоимости, повышении иммуногенности и эффективности вакцины, обеспечении полной защиты животных от клостридиозов.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Сулейменова Мерует Амантаевна Хусаинов Дамир Микдатович Нур Курманалиулы Амиргазиев Ералы Куанышбаевич Амиргазиева Макпал Куанышбаевна Ахметсадыкова Шынар Нурлановна Ахметсадыкова Назия Нурлановна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРАДЗОТА, ИНФЕКЦИОННОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ, ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ОТЕКА ОВЕЦ И ДИЗЕНТЕРИИ ЯГНЯТ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к технологии изготов-ления вакцинных препаратов, и может быть исполь-зовано при производстве поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят. 16260 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к технологии изготовления вакцинных препаратов, и может быть использовано при производстве поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии,злокачественного отека овец и дизентерии ягнят. Известен способ изготовления поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, включающий культивирование штаммов,и -типов В, С и Д на жидкой питательной среде, обработку формалином, концентрирование, составление серии смешиванием анакультур и расфасовку (Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты.М. Сельхозиздат, 1963.- с.203-210). Недостатком существующего способа является дороговизна способа, и то, что получаемый по нему препарат не обеспечивает полной защиты животных от клостридиозов, обладает слабыми антигенными и иммуногенными свойствами, так как при введении препарата вырабатывается только антимикробный иммунитет, и не вырабатывается антитоксический. Задачей изобретения является снижение себестоимости способа, повышение эффективности вакцины, ее защитных и иммуногенных свойств, создание у животных высокого антитоксического иммунитета. Задача достигается путем введением в питательную среду недорогих органических субстратов и микроэлементов, а также обогащением вакцины анатоксинами клостридий,-итипов В, С и Д. Преимущество предлагаемого способа выражается в снижении себестоимости, повышении иммуногенности и эффективности вакцины, обеспечении полной защиты животных от клостридиозов. Способ изготовления поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии,злокачественного отека овец и дизентерии ягнят,включающий культивирование штаммов,итипов В, С и Д на жидкой питательной среде,содержащей перевар Хоттингера, гидролизат гороха и сои, печеночный экстракт, гидролизат казеина, пептон, сухой дрожжевой экстракт, натрий хлористый,твин 80, однозамещенный фосфатно-кислый калий,двузамещенный фосфатно-кислый натрий, глюкоза,-аргинин, пропионол Б-400, кальций хлористый,магний сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислая, железо сернокислое и дистиллированную воду, обработку формалином, концентрирование,составление серии смешиванием анакультур, обогащение их анатоксином клостридий,итипов В, С и Д, расфасовку вакцины. Способ осуществляется следующим образом. Пример 1. 1. Для приготовления вакцины используют питательную среду следующего состава. Состав жидкой споруляционно-ростовой среды (мас.) 2 Перевар Хоттингера 10-15 Гидролизат гороха и сои 10-15 Печеночный экстракт 5-10 Гидролизат казеина 5-10 Пептон 0,2-0,5 Сухой дрожжевой экстракт 0,4-0,6 Натрий хлористый 0,2 Твин 80 0,05 Однозамещенный фосфатно-кислый калий 0,3 Двузамещенный фосфатно-кислый натрий 1,8 Глюкоза 0,2(рН 7,20,2) остальное. Питательную среду кипятят в течение 20-30 минут, фильтруют и разливают в бутыли по 8 л. На готовую среду наслаивают вазелиновое масло и стерилизуют при температуре 115-118 С в течение 4550 минут, рН готовой среды составляет длятипа С,и 7,8-8,0, а длятипа В и Д 8,0-8,5. 2. Выращивание расплодок производственных штаммов. Штаммы ежегодно получают из специализированного учреждения Республики Казахстан в двух дубликатах, с соответствующими на них паспортами. Разрешается закупать штаммы в ВГНКИ ветпрепаратов (г. Москва). Каждым из данных штаммов, предварительно освеженных посевом в питательную среду из МППБ(мясо-пептонный печеночный бульон) под вазелиновым маслом, засевают бутыли с питательной средой. Перед засевом культур (матры) в питательную среду добавляют 40-50 раствор стерильной глюкозы из расчета содержания в среде 0,5 сухого вещества. Засев производят в глубину питательной среды с температурой 37-38 С из расчета 10 мл культуры на литр среды. Засеянные культурыидля выращивания помещают в термостат при температуре 37-38 С на 18-20 часов,культурыВ, С и Д - на 6-12 часов. После этого их проверяют на чистоту роста путем высевов на питательную среду из МПА (мясопептонный агар-агар), МПБ (мясо-пептонный бульон), МППБ под вазелиновым маслом и молоко, а также путем микроскопии мазков. При наличии типичной морфологии культур производят засев питательной среды в реакторах. 3. Глубинное культивирование производственных штаммов. Для культивирования и последующей обработки каждой культуры используют отдельный реактор. Стерилизацию питательной среды проводят при 16260 118-120 С в течение 40-60 минут, рН среды после стерилизации -7,4-7,6 определяют потенциометрически. Химические показатели готовой питательной среды должны быть следующими аминного азота 17010 мг, триптофана - 50-75 мг, пептона - не ниже 30,5 . После стерилизации среду быстро охлаждают до 50 С путем подачи холодной воды в рубашку реактора и оставляют для равномерного снижения температуры по всему объему реактора до 38-39 С. До посева культур в питательную среду добавляют 4050 -ный раствор стерильной глюкозы из расчета 0,5 сухого вещества. При посеве в реактор через посевную трубку вносят 2-4 литра активно растущей культуры на каждые 100 литров среды. Культурыивыращивают в течение 18-24 часов при температуре 37-38 С. Культурутипов С, В выращивают в течение 4-8 часов,типа Д -в течение 1618 часов при температуре 37-38 С. В процессе роста культуртипа Д производят подкормку их 40-50 раствором глюкозы из расчета 0,5 сухого вещества с предварительным подщелачиванием 10 -ным раствором едкого натра. Для этоготипа В через 6-8 часов культивирования до рН 7,0-7,2, после чего добавляют глюкозу.типа Д подщелачивают два раза. Через 6-8 часов до рН 7,0-7,2 и через 14-16 до рН 7,8 после чего добавляют глюкозу (за 2 часа до окончания роста). В процессе роста производят микроскопию культур. В мазках должны быть палочки типичные для. Концентрация микробных тел должна быть в пределах 4-7 млрд. в 1 мл. Культуру проверяют на чистоту роста путем посева на МППБ, МПА и МПБ. Культуры должны иметь чистый рост на МППБ и типичную морфологию при отсутствии роста в МПБ и на МПА. 4. Обработка культур формалином Во всех культурах (крометипа Д) устанавливают рН 6,8-7,0 и добавляют 0,65 формалина с 37 содержанием формальдегида. К культуредобавляют 0,86 формалина. В культуретипа Д устанавливают рН 8,0-8,3. Затем в реактор с этой культурой добавляют стерильный раствор трипсина,культуру в реакторе хорошо перемешивают при температуре 37-38 С в течение 1,5-3 часов с периодическим перемешиванием содержимого реактора через каждые 30 минут. В реакторе с активированной культурой устанавливают рН 6,8-7,0 и добавляют 0,65 формалина, тщательно перемешивают мешалкой и выдерживают при температуре 37-38 С в течение 7-9 суток с ежедневным перемешиванием 2-3 раза в день. По истечении указанного времени формализованные культуры проверяют на чистоту и стериль ность и в реакторы с формалинизированными культурамиитипа Д добавляют коллоидный раствор гидроокиси алюминия в количестве 15-18 и 20 длятипа В или С. Содержимое всех реакторов тщательно перемешивают и оставляют при температуре 18-20 С в течение 2-5 суток до просветления надосадочной жидкости. После просветления анакультур их концентрируют путем декантации прозрачной надосадочной жидкости в количестве 60 от общего объема анакультуры, 50 типов В и Д. Культуруконцентрируют до 50 первоначально объема,а в том случае, когда исходная концентрация микробных тел будет меньше 4 млрд. в 1 см 3 надосадочную жидкость удаляют в количестве, необходимом для получения 8 млрд. клеток в 1 см 3 препарата. Концентрированные анакультуры используют для составления поливалентной концентрированной гидроокисьалюминиевой вакцины против брадзота,инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят. 5. Приготовление анатоксина. При изготовлении поливлентного анатоксина для выращивания культур клостридий используют те же параметры питательной среды и культивирования, что и при получении бактериальной массы. По истечение культивирования бактериальную массу подвергают сепарированию, причем культурытипа Д, В,иподают на сепаратор до обезвреживания, а культурытипа С после добавления формалина. После обезвреживания в анатоксинах проводят определение количества антигена в единицах связывания и вносят гидрат окиси алюминия с целью сорбции растворимых антигенов. После окончания сорбции и определения процента сорбированного антигена, полученные анатоксины концентрируют с таким расчетом, чтобы в 1 мл анатоксиновсодержалось 100 ЕС антигена типа, анатоксинов 30 ЕС и анатоксинов 100 ЕС. Готовые монопрепараты смешивают в равных объемах для получения полианатоксина. 6. Составление вакцины. Для составления серии вакцины концентрированные анакультуры смешивают в соотношения- 8 ,8 ,типа В - 16 , типа С 16 , типа Д 16 , полианатоксин - 16 . К полученной смеси (температура 39) стерильно добавляют при постоянном перемешивании расплавленный 2,5 -ный агар-агар (в горячем виде) из расчета содержания в вакцине сухого агар-агара 0,1 . После этого рН вакцины доводят до 7,4-7,610 -ным раствором едкого натра или двууглекислой соды,вакцину тщательно перемешивают и расфасовывают. Вакцину, расфасованную во флаконы, проверяют на стерильность путем посева на МППБ, МПБ и МПА во флаконах и пробирках, затем ее хранят при 3 16260 температуре 18, 20 С. Через 15 дней из флаконов первичного посева в МППБ делают пересев на такие же среды. После этого ведут наблюдение за первичными и повторными посевами еще 5 дней. При условии стерильности вакцина передается на биологический контроль. 7.Биологический контроль Иммуногенную активность вакцины проверяют на 20 кроликах массой 1,8-2,2 кг, которым двукратно внутримышечно, с интервалом в 10-12 суток,вводят вакцину по 1,5 см 3 . Через 18-20 суток после второй прививки животных, по три кролика на каждую валентность, заражают заранее подтитрованными культурамитипов В и С и пять кроликов культурой. Одновременно с вакцинированными заражают в тех же дозах контрольных (невакцинированных) животных, по два кролика на каждый штамм. Для проверки активности вакцины по отношению ктипа Д у трех кроликов через 18-20 суток после второго введения вакцины из сердца берут кровь. Сыворотки крови, полученные от каждого кролика проверяют в реакции нейтрализации токсина на белых мышах массой 16-18 г по следующей методике испытуемая сыворотки и токсин в дозе 1 ДЛМ смешивают в равных объемах и выдерживают 45 минут при температуре (371) С,после чего смесь токсина и сыворотки крови каждого кролика вводят внутривенно в дозе 0,5 см 3 пяти белым мышам массой 16-18 г. Одновременно пяти белым мышам в дозе 0,25 см 3 внутривенно вводят токсин без сыворотки. Вакцину выпускают при выживании всех вакцинированных кроликов в течение 6 суток, при гибели контрольных в течение 24-72 ч. Допускается гибель по одному вакцинированному кролики из групп,зараженныхтипов В и С, и двух кроликов, зараженных. По отношению ктипа Д вакцину считают активной при выживании в течение суток не менее 10 мышей из 15, при гибели всех контрольных животных. Иммуногенность вакцины по отношению кпроверяют на 20 белых мышах массой 16-18 г. Десять животных иммунизируют испытуемой серией вакцины, которую вводят двукратно подкожно в дозе 0,5 см 3 с интервалом 15-18 суток. Десять белых мышей оставляют в качестве контроля. Через 18-20 суток после второго введения препарата всех животных (вакцинированных и контрольных) заражают сухой тест-культурой 1098 в дозе 3-5 ЛД 50. Учет результатов опыта проводят через 48 часов с момента заражения. Серию препарата считают активной по отношению к, если из 10 иммунизированных белых мышей после контрольного заражения выживает не менее 8 животных, а в контрольной группе погибает не менее 8 мышей. При гибели меньшего количества мышей в контрольной группе серию вакцины подвергают повторной проверке, а при выживании меньшего количества вакцинированных животных серию препарата перепроверяют в сравнении с сухим стандартом иммуногенности. Для этого 20 белых мышей массой 16-18 г иммунизируют сухим стандартным референспрепаратом и 20 животных прививают испытуемой серией вакцины. Препараты вводят двукратно, подкожно с интервалом между инъекциями 15-18 суток. Реферанспрепарат вводят в дозах по 0,1 см 3, а испытуемую серию - в дозах по 0,5 см. Через 18-20 суток после второго введения животных обеих групп и 10 контрольных мышей заражают сухой тест-культурой 1098 в дозе 3-5 ЛД 50. Серию препарата считают пригодной для практического применения, если в группах животных, иммунизированных как референс-препаратом, так и испытуемой серией вакцины выживает не менее 80 животных, при гибели не менее 80 мышей в контрольной группе. При неудовлетворительных результатах повторного контроля вакцину бракуют. Результаты опыта, приведенные в таблице 2,свидетельствуют о высоких защитных свойствах заявленной вакцины. Таблица 1 Сравнительные данные по способам изготовления поливалентной вакцины против брадзота,инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят Существующий способ 1 Анакультуры Перевар Хоттингера Печеночный экстракт Гидролизат казеина Пептон Натрий хлористый Глюкоза Дистиллированная вода 4 Анакультурыанатоксины По составу питательной среды 10-30 Перевар Хоттингера 10-15 20-30 Гидролизат гороха и сои 10-15 30 Печеночный экстракт 5-10 0,4-0,5 Гидролизат казеина 5-10 0,5 Пептон 0,2-0,5 0,5 Сухой дрожжевой экстракт 0,4-0,6 Продолжение таблицы 1 осталь Натрий хлористый 0,2 Твин 80 Однозамещенный фосфатно-кислый калий Двузамещенный фосфатнокислый натрий Глюкоза-аргинин Пропионол Б-400 Кальций хлористый Магний сернокислый Цинк сернокислый Медь сернокислая Железо сернокислое Дистиллированная вода Иммуногенные свойства предлагаемой вакцины в сравнении с коммерческой Вид животных Кролики Белые мыши Белые мыши Белые мыши ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения поливалентной вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, включающий культивирование штаммов,итипов В, С и Д на жидкой питательной среде,обработку формалином, концентрирование, составление серии смешиванием анакультур и расфасовку,отличающийся тем, что в питательную среду для культивирования дополнительно вносят гидролизат гороха и сои, сухой дрожжевой экстракт, твин 80,однозамещенный фосфатно-кислый калий, двузамещенный фосфатно-кислый натрий, -аргинин,пропионол Б-400, кальций хлористый, магний сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислая, Заболело,пало 0 0 0 0 1 0 0 1 2 2 2 2 0 1 10 железо сернокислое, а бактериальную массу дополнительно обогащают анатоксинами клостридий,итипов В, С и Д при следующем соотношении компонентов вакцины, об. анакультуры 88 типа В 16 типа С 16 типа Д 16 полианатоксин питательная среда