Способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микробa

(51) 12 1/02 (2006.01) 12 1/02 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ(57) Полезная модель относится к биотехнологии,медицинской микробиологии может быт использовано для бактериологического контроля питательных сред, лабораторного и промышленного изготовления, используемых в диагностических целях при исследовании на туляремию. Технический результат,обеспечиваемый полезной моделью, выражается в обеспечении биобезопасности при использовании рифампицинустойчивого аттенуированного штамма туляремийного микроба, пригодного для контроля качества туляремийных питательных сред,генетическая метка штамма даст возможность выявить случайное или преднамеренное загрязнение диагностического материала при исследовании на туляремию. Способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба,включающий культивирование штамма на питательной среде, отличающийся тем, что в качестве тест-штамма используют авирулентный,эпидемически неопасный, рифампицинустойчивый штамма 240, -.(72) Куница Татьяна Николаевна Некрасова Лариса Евгеньевна Рябушко Елена Александровна Силина Елена Николаевна Избанова Уйнкуль Айтеновна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева Агентства Республики Казахстан по защите прав потребителей(56) Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии,бруцеллеза, легионеллеза. Методические указания. МУ 3.3.2.2124-06,утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Онищенко Г.Г., 17 августа 2006 г., М.,2006. с. 13-15(54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБ Полезная модель относится к биотехнологии,медицинской микробиологии может быт использовано для бактериологического контроля питательных сред, лабораторного и промышленного изготовления, используемых в диагностических целях при исследовании на туляремию. Известен способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба, в котором используются штаммы .15 М (линии НИИЭГ),503/840, .В 399 и .120 Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы,холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза,легионеллеза. Методические указания. МУ 3.3.2.2124-06,Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Онищенко Г.Г., 17 августа 2006 г., М.,2006. С. 13-15. Недостатком данного способа является то, что в качестве референс штамма используется вакцинный штамм .15 М (линии НИИЭГ), клетки которого по размерам в 2 раз больше вирулентных штаммов, при контроле качества питательных сред требуется дополнительный пересчет, а также штаммы 503/840,.В 399 и .120, все эти штаммы являются вирулентными особо опасными микроорганизмами,работа с которыми требует соблюдение биобезопасности -3 уровня. Задачей данного полезной модели был подбор авирулентного, эпидемически неопасного штамма туляремийного микроба с генетической меткой,пригодного для проверки качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры. Технический результат,обеспечиваемый полезной моделью, выражается в обеспечении биобезопасности при использовании рифампицинустойчивого аттенуированного штамма туляремийного микроба 240, -, пригодного для контроля качества туляремийных питательных сред,генетическая метка которого даст возможность выявить случайное или преднамеренное загрязнение диагностического материала при исследовании на туляремию. Способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба,включающий культивирование штамма бактерии туляремии на питательной среде, отличающийся использованием в качестве тест-штамма авирулентного,эпидемически неопасного,рифампицинустойчивого штамма 240, -. Идентификацию штамма бактерии проводят по основным культурально-морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно. - . - 2007. 110 . Номенклатурные данные Семейство 2 РодВид(,1912) Подвид .(,1966) Культурально-морфологические свойства. Мелкие, грамотрицательные коккобактерии, не растут на мясопептонном бульоне и агаре, на свернутой желточной среде Мак-Коя культура имеет вид извилистого, слегка блестящего, под цвет среды нежного налета, не резко выраженной слизистой консистенции, легко снимающегося петлей, на кровяном агаре - рост еровато-голубой с зеленным оттенком,блестящий,слизистой консистенции. Оптимальная температура роста 37 С,7,2. Биохимическая активность штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глицерин, глюкозу,мальтозу, маннозу. Не разлагает сахарозу, лактозу,маннит. Обладает ферментом цитруллинуреидазой,оксидаза отрицательный,каталаза слабо положительный,уреаза и бета-лактамаза отрицательный. Обладает полным набором антигенов,выявляется в концентрации 6,3 х 105 м. к. в РПГА с иммуноглобулиновым туляремийным эритроцитарным диагностикумом. При простановке ПЦР обнаруживается специфическая последовательность 16 -гена праймерами 5-11, характерная для всех представителей рода , и фрагмента гена 1 А, кодирующего 17 липопротеин,специфичного для вида. Специфические родовые и видовые тесты выявляются при постановке ПЦР в реальном времени с системой праймеров(50) для белых мышей рифампицинустойчивого варианта аттенуированного штамма 240, - равна 105 м. к. Штамм иммуногенный,обладает протективной активностью, иммунизированные морские свинки не погибают при подкожном заражении 1000 смертельных доз вирулентного штамма. Способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба осуществляется следующим образом. Пример 1. Пригодность штамма 240, -, для контроля качества питательных сред. Опыт проводят параллельно с штаммом.15 М (линии НИИЭГ),503. Для проверки качества питательных сред используют 48-часовые культуры туляремийного микроба, выращенные на желточной среде Мак-Коя при температуре 37 С. Готовят взвеси микробов в 0,9-ном растворе хлористого натрия из штаммов 240, -,503, .15 М. Доводят концентрацию микробных взвесей до 10 единиц по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича ОСО 42-25-59-86 П и разводят в 10 раз (к 0,5 см 3 взвеси добавляют 4,5 см 3 0,9-ного раствора хлористого натрия). Полученное разведение культуры эквивалентно 1109 м.к.см 3. Из исходных стандартных взвесей готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 см 3 культуры в 4,5 см 3 0,9-ного раствора хлорида натрия. По 0,1 см 3 микробной взвеси из разведения 10-6 и 10-7 (соответственно по 100 и по 10 м.к. на чашку) наносят на 3 чашки Петри с -агаром. Взвесь распределяют покачиванием по поверхности среды. Учет результатов производят до 10 суток инкубации посевов при температуре (371)С. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Из представленных в таблице 1 данных видно,что заявляемый штамм 240,- дает аналогичные результаты,что и вирулентный штамм туляремийного микроба 503. Пример 2. Контроль чувствительности тест - штамма туляремийного микроба к ингибиторам роста селективных сред. При эпизоотологическом обследовании на туляремию пользуются средами с антибиотиками,которые наносятся на поверхность питательной среды или добавляются непосредственно в среду перед розливом. Антибиотики подбираются таким образом, чтобы они подавляли постороннюю микрофлору,но не задерживали рост туляремийного микроба. Наибольшее распространение в лабораторной практике нашел пенициллин (100 ЕД на мл среды), ампициллин(50 ЕД/мл), кефзол (10 мкг/мл), амфотерицин В (10 мкг/мл), ристомицин (40 мкг/мл). Для проверки чувствительности предлагаемого тест - штамма туляремийного микроба к ингибиторам роста готовят -г с добавлением ингибиторов роста посторонней микрофлоры. Используют 48-часовые культуры туляремийного микроба, выращенные на желточной среде Мак-Коя при температуре 37 С. Взвесь микробов готовят в 0,9-ном растворе хлористого натрия аналогично примеру 1. Путем десятикратных разведений взвесь титруют до разведения 10-6, по 0,1 мл (100 микробных клеток) засевают на поверхность среды с ингибиторами посторонней микрофлоры и без ингибиторов,равномерно распределяя покачиванием. Каждый посев делают на 3 чашки испытуемой среды. Контролем служит питательная среда без ингибиторов. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2. Из приведенных в таблице 2 данных отчетливо видно, что используемые в эксперименте антибиотики не влияют на рост штамма 240, -. Данный штамм может быть использован для контроля питательных сред,содержащих ингибиторы посторонней микрофлоры. Использование предложенного способа контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба позволит обеспечить биобезопасность данной процедуры, генетическая метка штамма даст возможность выявить случайное или преднамеренное загрязнение диагностического материала при исследовании на туляремию. Таблица 1 Результат контроля качества питательных сред с использованием штаммов 240,-,503, .15(линии НИИЭГ)чашки Результат изучения чувствительности тест-штамма 240, - к ингибиторам роста посторонней микрофлорычашки ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Способ контроля качества диагностических питательных сред для туляремийного микроба,включающий культивирование штамма на