Способ диагностики эхинококкоза лошадей

(51) 01 33/569 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антропозоонозов, и может быть использовано для диагностики ларвального эхинококкоза лошадей. Способ диагностики эхинококкоза лошадей,включающий взятие крови у исследуемых лошадей,отделение сыворотки, постановку реакции непрямой иммунофлуоресценции, при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный эхинококковым антигеном, в качестве индикаторной системы антивидовая к иммуноглобулину лошадей меченная флуорохромом сыворотка. Способ прижизненной диагностики эхинококкоза лошадей имеет следующие преимущества сокращается время на проведение реакции, значительно удешевляется исследование,повышается достоверность исследования.(72) Сабаншиев Мажит Хусаинов Дамир Микдатович Мауланов Амангельды Заманович Джанабекова Гульмира Кумискалиевна Джанабеков Кумискали Мухитдинова Гульнара Ергалиевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭХИНОКОККОЗА ЛОШАДЕЙ Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике антропозоонозов, и может быть использовано для диагностики ларвального эхинококкоза лошадей. Известен способ диагностики эхинококкоза,включающий взятие крови и е исследование, при этом для его осуществления берут 0,02 мл эхинококковой жидкости и добавляют 0,08 мл исследуемой крови, инкубируют 2 ч при 37 С и вносят 0,9 мл изотонического раствора хлористого натрия. Далее центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, в надосадочной жидкости определяют содержание калия, и при превышении содержания калия на 45 и более по сравнению с контролем, не содержащего антигена, диагностируют эхинококкоз. На данный способ получения антигена имеется патент Российской федерации 2024874 Адамбеков Д.А., Морозов .Л., Акматов Б.А.,Бошкоев Ж.Б., Рыскулов Э.Р., Кенжаев М.Г.,Мухамеджанов А. Способ диагностически эхинококкоза, Патент РФ 2024874, Кл. 01 33/53, 15.12.1994 г Недостатком способа можно считать необходимость постоянного поиска достаточного количества нативного инвазионного материала,получаемого на мясокомбинатах их эхинококкозных цист, локализованных на внутренних органах спонтанно зараженныховец и крупного рогатого скота. Получаемый антиген сложно стандартизировать, так как материал для его выделения поступает неоднородный. Наиболее близким прототипом служит способ диагностики эхинококкоза, включающий взятие крови и е исследование путем выявления антител к антигенам эхинококка, основанную на применении фракционированного антигена молекулярной массой 43 кДа, получаемого из цистной жидкости и протосколексов, причем источником паразитарного материала служат спонтанно инвазированные эхинококкозом сельскохозяйственные животные (овцы, крупный рогатый скот). На данный способ получения антигена имеется авторское свидетельство 1363564 1989 года Клименко В.В., Белозеров С.Н.,Шеховцов Н.В. Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа, А.с. 1363564,1989 г Недостатком прототипа также можно считать необходимость постоянного поиска достаточного количества нативного инвазионного материала,получаемого на мясокомбинатах их эхинококкозных цист, локализованных на внутренних органах спонтанно зараженных Е. овец и крупного рогатого скота. Получаемый антиген сложно стандартизировать, так как материал для его выделения поступает неоднородный. Цель изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективного способа прижизненной диагностики эхинококкоза лошадей на основе метода непрямой иммунофлуоресценции,с использованием сенсибилизированных эритроцитов барана. 2 Техническая сущность изобретения состоит в разработке эффективного экспресс-метода прижизненной диагностики эхинококкоза лошадей. Это достигается тем, что в способе постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции используют в качестве антигена стабилизированный эритроцитарный диагностикум,сенсибилизированный эхинококковым антигеном, а в качестве индикаторной системы антивидовую к иммуноглобулину лошади меченную флуорохромом сыворотку. Пример осуществления этого способа. Реакцию ставят на обезжиренном предметном стекле. Для реакции необходимы следующие компоненты формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные эхинококкозным антигеном, исследуемые сыворотки крови лошадей,положительные и отрицательные контрольные сыворотки лошадей,физиологический забуференный раствор,антивидовая к иммуноглобулину лошадей люминисцирующая сыворотка и люминисцентный микроскоп. Для изготовления сенсибилизированных эритроцитов барана зрелые членики цестоды, наполненные яйцами и содержащие онкосферы,получают от экспериментально зараженных собак. Членики разрушают механическим путем и отмывают яйца путем центрифугирования в физиологическом растворе поваренной соли при 1000 об/мин в течение 5 минут, дважды. Отмытые яйца последовательно подвергают обработке искусственным желудочным соком (0,35 соляной кислоты, 0,15 пепсина), а затем искусственным кишечным соком (5 едкого натрия, 0,1 панкреатина). При этом на каждые 100 тыс. яицрасходуют по 5 мл,обработку искусственным желудочным соком осуществляли в течение 1,5-2 ч, а кишечным соком 15-20 минут при температуре 37-38 С. После обработки желудочным соком яйцаотмывают путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 минут в физиологическом растворе натрия хлорида, а после обработки кишечным соком, освободившиеся онкосферы средой культивирования. Отмытые онкосферы помещают в среду культивирования, из расчета на 100 тыс. онкосфер 40-50 см 3, в которой происходит культивирование в течение 48-50 часов при температуре 37-38 С. Среду культивирования готовят из следующих ингредиентов, мл нативная сыворотка 2-3 месячных телят, 50 см 3 (10) бензилпенициллина калиевая соль 0,15 см 3 (0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) - 0,03 стрептомицина сульфат 0,1 см 3 (0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) - 0,02 и среда 199 - остальное до 500 см 3. По истечении срока культивирования онкосферы превращаются в протосколексы, количество которых доводят до 2000100 экземпляров в 1 см 3 среды. С целью усиления антигенных свойств протосколексов подвергают обработке ультразвуком 8,0-9,0 и подвергают ультразвуковой лизат автоклавированию при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., затем остужают до температуры 18-25 С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный лизат (сенситан) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при температуре 50-60 С в течение 30 мин. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина,которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца противоэхинококковой сыворотки. Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНГА отрицательной сыворотки и стандартного образца противоэхинококковой сыворотки. Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс). Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНГА, проводится путем обработки 10 взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями(1,0 1,5,) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНГА антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента. Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина,необходимую для получения стандартного антигена для РНГА с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов(предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца противоэхинококковой сыворотки. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 см 3 5-ной их взвеси добавляют по 0,5 1,0 1,5 2,0 см 3 сенситина. Антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1-ная концентрация додецилсульфата натрия,позволяющая получить эритроцитарный антиген,обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,01,5 см 3 его на 1 см 3 5-ной взвеси формалинизированных эритроцитов,предварительно обработанных детергентом. Следовательно, обработка эритроцитов 1,0-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 см 3 сенситина на 1 мл 5-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и активный эхинококкозный эритроцитарный антиген для непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ). Для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-58 С ) в течении 10 секунд. Каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток(испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15. Далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором. Мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину лошади меченную сыворотку в рабочем разведении и снова их помещают в термостат для инкубирования. По истечении 30-40 минут мазки снова промывают забуференным физиологическим раствором, высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Обычно наблюдают следующую картину при отрицательном результате эритроциты светятся тусклым сероватым цветом, или светящихся эритроцитов нет. В препаратах, с положительной реакцией,наблюдается желто-зеленое периферическое свечение эритроцитов. Интенсивность свечения оценивают в крестах 4 - яркая, светящаяся желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 3 - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 2 - неяркая периферическая люминесценция эритроцитов желтого цвета 1 - слабая периферическая люминесценция эритроцитов желто-серого цвета- - отсутствие специфической люминесценции. Контролем служит заведомо отрицательная и положительная противоэхинококковая сыворотка лошадей. Способ прижизненной диагностики эхинококкоза лошадей имеет следующие преимущества сокращается время на проведение реакции, значительно удешевляется исследование,повышается достоверность исследования. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики эхинококкоза лошадей,включающий взятие крови и ее исследование,отличающийся тем, что из крови исследуемых лошадей отделяют сыворотку и осуществляют 3 постановку реакции непрямой иммунофлуоресценции, при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный эхинококковым антигеном, а в качестве индикаторной системы - антивидовые к иммуноглобулину лошадей меченные флуорохромом сыворотки, для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов,мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-5-8 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток лошадей (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15, далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 3040 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором, мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину лошадей меченной сыворотки в рабочем разведении, снова их помещают в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией.