Способ выделения ДНК из бактериальных клеток возбудителей энтероинфекций.

(51) 12 19/34 (2006.01) 07 21/04 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток. Культуру клеток энтеробактерии выращивают на твердой питательной среде,инактивируют хлороформом и смывают с поверхности среды. В полученную суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1 и инкубируют при температуре 37 С в течение 1 часа. Затем ДНК очищают от клеточного детрита и проводят ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти днем. Способ позволяет получить высокоочищенную хромосомную ДНК возбудителей энтероинфекций в препаративном количестве и с длительным сроком хранения.(72) Бияшев Кадыр Бияшевич Бияшев Биржан Кадырович Киркимбаева Жумагул Слямбековна Макбуз Аманжол Жасбилим Ермагамбетова Светлана Емлсовна Туганбаева Айжамал Нуралыызы(56) Фурсов В.В., Попов Ю.А. Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба. Микробиология, генетика и иммунология чумы и холеры. Саратов, 1983, с.31-34(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЭНТЕРОИНФЕКЦИЙ. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных работах для создания новых профилактических и диагностических препаратов,получения биологически активных веществ. Постоянный рост народонаселения и возрастающие потребности в полноценном питании людей требуют неуклонного роста производства продуктов животноводства. Важнейшим условием выполнения такого роста является скорейшее внедрение достижений биотехнологии в производство, разработка новых, перспективных,быстроокупаемых методов и средств диагностики,лечения и профилактики заболеваний животных. Проблема энтеробактериоциноза животных приобретает все большую актуальность. Это связано с широкой циркуляцией многочисленных сероваров возбудителей энтероинфекций в природе,полидетерминантностью факторов вирулентности возбудителей, полиэтиологичностью, разнообразием путей внедрения в организм животного и человека, а также селекцией и циркуляцией штаммов, несущих- факторы, сформировавшихся под влиянием антибиотиков и химиопрепаратов. Ущерб,наносимый этой инфекцией заключается не только в гибели животного, но и в том, что переболевшие животные в течение длительного периода времени являются бактерионосителями и становятся постоянными источниками контаминации окружающей среды. Продукты животного происхождения (мясо, молоко, яйца), полученные от животных - бактерионосителей при недостаточной тепловой обработке могут вызвать пищевые токсикоинфекции у людей и борьба с пищевыми токсикоинфекциями является распространенной,повседневной задачей ветеринарных и медицинских работников. Основой профилактики энтеробактериоциноза животных является серо- и вакцинопрофилактика. Традиционные вакцинные препараты изготовляют на основе ослабленных, инактивированных или дезинтегрированных возбудителей болезней. Проблемой живых вакцин - реактогенность и возможность реверсии к исходному состоянию, а инактивированных вакцин является то, что при инактивации возбудителя утрачивается большая или меньшая часть его иммуногенной структуры под влиянием физико-химических воздействий на микробную клетку. Отсюда необходимость введения больших доз, многократность прививок. Современные биотехнологические разработки предусматривают создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вакцины обоих типов основаны на генно-инженерном подходе. В последние годы в вакцинологии сформировалось новое направление, когда в организм вводится чужеродный ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют генными, вакцинами из нуклеиновых кислот. Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к методам выделения ДНК. Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецилсульфат натрия, в качестве индукторов лизиса клеточной стенки с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом ( // . .- 1961. - . 3. - .208-218). Данный метод трудоемок в исполнении и применяются токсичные материалы. Известен способ выделения ДНК (Фурсов В.В.,Попов Ю.А. Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба. //Микробиология, генетика и иммунология чумы и холеры, Саратов, 1983, С.3134). Выращенную на жидкой питательной среде культуру осаждают центрифугированием, отмывают трис-сахарозой,затем полученный осадок суспендируют в указанном растворе с последовательным добавлением компонентов лизирующего раствора, включающего лизоцим,ЭДТА, тритон Х-100 и инкубируют при 4 С в течение 16 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 1 ч при 20000 об/мин. Затем осуществляют очистку ДНК от компонентов клетки и выделяют плазмидную ДНК в градиенте плотности хлористого цезия с добавлением этидиума бромида, с последующим отбором ДНК и освобождением от этидиума бромида. В описанном способе выделения ДНК используют многокомпонентный лизирующий раствор, что делает этот процесс трудоемким,длительным, дорогостоящим, а также отсутствует этап инактивации культуры, что не позволяет работать с вирулентными штаммами патогенных микроорганизмов. Цель изобретения способ выделения хромосомной ДНК высокой степени очистки из бактериальных клеток производственных штаммов возбудителей энтероинфекций. Сущность изобретения заключается в том, что культуру, выращенную на твердой питательной среде, инактивируют хлороформом, смывают с поверхности среды и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1, затем инкубируют при температуре 37 С в течение 1 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 25000 . Предлагаемый способ выделения хромосомной ДНК осуществляют следующим образом культуру бактериальных клеток, выращенную на твердой питательной среде в колбе Тартаковского,инактивируют хлороформом. Затем культуру смывают 5 раствором сахарозы вбуфере,добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1 и инкубируют в течение 1 ч при 37 С. Осаждение детрита осуществляют центрифугированием при 25000 в течение 30 мин. В супернатант добавляюти этанол, после инкубации ДНК осаждают центрифугированием при 15000 в течение 30 мин, суспендируют в буфере и добавляют хлористый цезий и бромистый этидий. Белки из раствора удаляют центрифугированием при 25000 в течение 40 мин. Жидкую фазу, содержащую ДНК, центрифугируют при 200000 в течение 20 часов с последующим отбором хромосомной ДНК. Отобранную ДНК по общепринятой методике освобождают от бромистого этидия. Заявляемый способ подробно описан в примерах. Пример 1. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма 12. Исследуемого штамма .12 высевают на чашку Петри с плотной агаровой средой( 7,2) или агара Хоттингера ( 7,2) и выращивают при температуре 37 С. После 24 часовой инкубации культуральную массу бактерий пересевают в колбу Тартаковского со скошенным агаром( 7,2) или агара Хоттингера ( 7,2). Спустя 24 ч инкубации при температуре 37 С в колбу добавляют 0,5 мл хлороформа и дополнительно инкубируют 60 мин при комнатной температуре для инактивации культуры. Культуру смывают 5-ю мл 5-ного раствора сахарозы в(состав -буфера трис(гидроксиметиламинометан) 5 мМ, динатриевая соль этилендиаминтетра-уксусной кислоты 0,5 мМ, 5 мМ,8,0) с использованием стеклянного шпателя, переносят пастеровской пипеткой в герметично закрывающиеся центрифужные стаканы ротора-20 (40 мл) центрифуги 2-21, добавляют тритон Х-100 до концентрации 1 и лизируют в течение 1 ч при температуре 37 С. Осаждение детрита осуществляют при 25000(12000 об/мин) в течение 30 мин. Супернатант отбирают, переносят в центрифужные стаканы ротора-14 (250 мл) центрифуги 2 - 21, добавляют навескудо конечной концентрации 1 М и два с половиной объема 96 этилового спирта (или один объем 2 изопропанола). Инкубируют в течение ночи при температуре 4 С. После инкубации содержимое центрифугируют при 15000 (10000 об/мин) в течение 30 мин. Осадок суспендируют ви переносят в центрифужные стаканы ротора-20 с добавлением навески хлористого цезия (1,1 мг/мл) и 1/10 объема бромистого этидия (5 мг/мл). Флотацию белков производят при 28000(10000 об/мин) в течение 40 мин. Жидкую фазу переносят в пробирки для ультрацентрифугирования ротора 70,1(3,5 мл) центрифуги 100 и центрифугируют при 250000(60000 об/мин) в течение 20 ч при температуре 4 С. Отбор верхней полосы осуществляют при длинноволновом ультрафиолетовом свете(10 мл) центрифуги 2-21 стандартным способом через иглу (Маниатис Т. с соавт., 1984). После отбора содержимое разводят 11 и смешивают с одним объемом 2-изопропанола,оставляют в ночь при температуре -20 С. Последующее центрифугирование проводят при 20000(10000 об/мин) в течение 15 мин. Растворение осадка ДНК и переосаждение с этанолом осуществляют по стандартной методике(Маниатис Т. с соавт., 1984). Количество хромосомной ДНК, выделенной из культуры штамма 12 выращенного на скошенном агаре, составляет до 145 мкг. Пример 2. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма 09. Выращивание культуры и выделение ДНК проводят в тех же условиях, что и в примере 1. Выход ДНК из одинакового количества биомассы соответствует примеру 1 и составляет 145 мкг. Пример 3. Выделение хромосомной ДНК из клеток штаммаК-20. Культуру выращивают при температуре 37 С. Выделение ДНК проводят аналогично примеру 1. Выход ДНК составляет 205 мкг, что в 1,5 раза больше, чем в примере 1, так как количество получаемой биомассы клетокбольше. Использование в качестве лизирующего вещества тритона Х-100 позволяет обойтись без литических ферментов, тем самым сокращается число операций с клеточным лизатом. Это способствует уменьшению возможности гидродинамического повреждения нуклеиновых кислот, а оптимально подобранные температурные условия и концентрация лизирующего вещества обеспечивают мягкий и полный лизис клеток бактерий. Предлагаемый для осаждения клеточного дебриса режим центрифугирования 25000 в течение 30 мин обеспечивает осветление лизата при сокращении времени данной операции. Следует отметить эффективность заявляемого способа, заключающегося в сокращении времени выделения хромосомной ДНК, увеличении выхода конечного продукта, а также его экономичность,достигаемая за счет использования однокомпонентного лизирующего раствора,позволяющего эффективно осуществлять лизис клеток. Из культуры, выращенного на скошенном агаре, выход целевого продукта составляет от 145 мкг до 205 мкг для различных микроорганизмов. Предлагаемый способ выделения позволяет при соблюдении санитарных правил СП 1.2.011-94 Безопасность работы с микроорганизмами-игрупп патогенности получать хромосомную ДНК высокого уровня очистки, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов,получения биологически активных веществ из клеток как авирулентных, так и вирулентных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной природы. Таким образом, разработан эффективный, более экономичный способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток, позволяющий работать с патогенными микроорганизмами,получать высокоочищенную хромосомную ДНК, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов,получения биологически активных веществ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток возбудителей энтероинфекций,включающий выращивание культуры, лизис клеток, очистку ДНК от компонентов клетки и ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием с последующим удалением бромистого этидия, отличающийся тем, что культуру,выращенную на твердой питательной среде,инактивируют, смывают и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1, затем инкубируют в течение 1 ч. при температуре 37 С.