Способ получения бактериального препарата ” турингин-ф” комплексного действия

(51) 01 63/00 (2006.01) 01 7/04 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 12 1/07 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения бактериального препарата Турингин-Ф комплексного действия путем выращивания штамма. 20/3 в питательной среде последовательно в колбах на качалке, в инокуляторах, в ферментерах. Отличается тем, что культивирование проводят в питательной среде, содержащей соевую муку,пшеничную муку, глюкозу и обогащенной минеральными солями, при этом у штамма проявляется комплексная активность против листогрызущих насекомых, стеблевых нематод и возбудителей корневых болезней растений. Количество живых клеток в форме спор в 1 мл жидкого препарата не менее 1,5-3 млрд КОЕ/мл. При получении пастообразной формы в качестве адсорбента и наполнителя используется бентонит. Содержание жизнеспособных клеток в 1 г пастообразного препарата не менее 10,0 млрд КОЕ/мл.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиевна Шемшура Ольга Николаевна Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Бекмаханова Надия Ермухановна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ТУРИНГИН-Ф КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способу получения нового бактериального препарата Турингин - Ф комплексного действия против листогрызущих насекомых, стеблевых нематод и возбудителей корневых болезней растений. Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способу получения нового бактериального препарата Турингин-Ф комплексного действия против листогрызущих насекомых, стеблевых нематод и возбудителей корневых болезней растений. Известен способ получения жидкого инсектицидного препарата на основе культуры(Патент 2149551) методом жидкостного глубинного культивирования на дрожжеполисахаридных средах или на средах с кукурузным экстрактом и глюкозой. Полученную культуральную жидкость сепарируют и высушивают на распылительной сушилке с натрием хлористым. Полученный концентрат смешивают с водой, добавляют твин, мыло хозяйственное,хвойные отдушки, неонол и получают водную фракцию. Масляная фракция готовится путем смешивания консерванта глицерина и суспенгатора - парафинов нефтяных жидких. Обе фракции - водная и нефтяная - смешиваются и гомогенизируются при давлении 100-200 атм. Недостатком способа является усложненный,многоступенчатый путь до готового продукта,который приводит к его удорожанию, а также активность получаемого препарата только в отношении листогрызущих насекомых. Известен также другой способ получения жидкого инсектицидного препарата (Патент 2314691) путем культивирования-52 В 5351 на стандартной дрожжеполисахаридной среде-1,5 мука пшеничная или мука кукурузная-0,015-0,05 Недостатком способа, принятого за прототип,является получение препарата узкого спектра действия только на насекомые, отсутствие активности против других вредителей растений, что сужает область его использования. Целью изобретения является разработка простого и экономичного способа получения препарата комплексного действия против листогрызущих насекомых,нематод и фитопатогенов. Эта цель достигается путем культивирования штамма.20/3 на питательной среде, содержащей соевую муку,пшеничную муку, глюкозу и обогащенную минеральными солями (СПС). Штамм.20/3 депонирован в РГП на ПХВ Республиканской коллекции микроорганизмов КН МОН РК под номером - -0527. Сущность изобретения подтверждается следующими примерами. Пример 1. Способ приготовления жидкого препарата в ферментере 2 Выращивание культуры.штамм 20/3 производят на питательной среде следующего составаСоевая мука- 6,5-7,5 Для получения маточной культуры суспензию клеток.штамма 20/3 засевают в колбы (2-3 штук) вместимостью 750 мл, содержащие 250 мл питательной среды выше указанного состава и культивируют на качалке при 200 об/мин в течение 24 ч при температуре 28 С. Для получения посевного материала односуточную маточную культуру в количестве 5 засевают в колбы с питательной средой того же состава (10 колб) и культивируют на качалке при 200 об/мин в течение 24 ч при температуре 28 С. Наработку культуральной жидкости производят в ферментере с мешалкой, вместимостью 50 л . Питательную среду выше указанного состава готовят в ферментере и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. После охлаждения питательной среды до 28 С в нее засевают 5 посевного материала. Культивирование производят при следующем режиме Температура культивирования - 28 С Обороты мешалки - 300-400 об/мин Расход технологического воздуха - 0,6 /мин Время культивирования - 120 часов. Конечный продукт - препарат, представляющий собой культуральную жидкость бактерий.штамма 20/3,содержащую споро-кристаллический комплекс. Титр клеток в 1 мл жидкого препарата не менее 1,5-3 КОЕ/мл. Для получения рабочей культуры при практическом применении препарат разводят в водопроводной воде, в соотношении 110 до титра 1,5-3108 кл/мл. Препарат Турингин-Ф также можно приготовить в виде пасты. Пример 2. Способ приготовления пастообразного препарата Турингин-Ф Для этого в культуральную жидкость,полученную после ферментации, описанной в примере 1, добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита (бентонит растворяют подогретой до 80-90 С водой за 2 ч до употребления), смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. За это время биомасса адсорбируется на бентоните и осаждается. Объем плотного осадка составляет 40-50 от общего объема культуральной жидкости. Надосадочную жидкость декантируют, а оставшийся осадок центрифугируют при 3,5-4,0 тыс. об/мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий в количестве 40-50 г/л. Качество пастообразного препарата должно соответствовать действующим требованиям содержание жизнеспособных клеток в 1 г препарата, не менее 10,0 млрд КОЕ/мл,массовая доля влаги, не более 55,количество посторонних микроорганизмов к числу бактерий.штамма 20/3, не более 0,2. Перед применением препарат разводят в водопроводной воде в соотношении 130 до титра 1,5-3108 кл/мл. Пример 3. Проведены лабораторные испытания штамма.20/3 выращенного на среде СПС(препарат Турингин-Ф) против насекомых, нематод и возбудителей корневых болезней растений. Для этого жидкий препарат Турингин-Ф,полученный при росте штамма.20/3 на среде, содержащей соевую муку, пшеничную муку, глюкозу и обогащенную минеральными солями (СПС), как описано в примере 1, разводят водопроводной водой в соотношении 110 до концентрации 1,5-3108 спор/мл. Для сравнения используют культуральную жидкость бактерий.штамма 20/3, полученную аналогичным способом с использованием дрожжеполисахаридной среды (ДПС). Опыты проводят в 10-ти кратной повторности. При исследовании инсектицидной активности листья люцерны (для долгоносика) и картофеля (для колорадского жука) замачивают в культуральной жидкости штамма.20/3, выращенного на двух разных средах, с концентрацией 1,5-3108 спор/мл. После подсушивания листья переносят в чашки Петри и помещают в них личинки насекомых по 15 особей на чашку. Обработанным кормом личинки питаются трое суток, после чего корм меняют на необработанный. В качестве контроля используют стерильную водопроводную воду. Учет погибших насекомых проводят в течение 10 дней. Результаты представлены в таблицах 1-2. Исследования показали,что при культивировании штамма на среде П, гибель личинок листового долгоносика на 7-е сутки составляют 100, при росте на среде ДПС - 99. Полная гибель личинок колорадского жука в обоих отмечена на 5-е сутки. Для исследования нематоцидной активности в часовые стекла с культуральной жидкостью штамма, выращенного на средах СПС и ДПС,помещают по 20 экземпляров самых активных личинок нематод. Контролем служат варианты с водопроводной стерильной водой. Нематоды в культуральной жидкости оставляют на 72 часа, по истечению которых все неподвижные нематоды переносят в воду на 24 часа. Те нематоды, которые в течение этого времени не восстанавливают свою активность, считаются погибшими. Результаты представлены в таблице 3. Установлено, что смертность стеблевых нематодчерез 72 часа составляет 74,3(вариант СПС) и 3 (вариант ДПС). При исследовании антагонистической активности фитопатогенные микроорганизмы засевают сплошным газоном на твердую питательную среду Чапека (для грибов) и РПА (для бактерий) в чашки Петри. На свежезасеянный газон фитопатогена в стерильных условиях накладывают диск плотной фильтровальной бумаги (диаметр 8 мм), смоченный в культуральной жидкости штамма 20/3, выращенный на средах СПС и ДПС, с концентрацией 1,5-3108 спор/мл. Чашки Петри помещают в термостат при 28 С на 2-3 суток (время роста патогена). Об антагонистической активности штамма судят по отсутствию роста патогена вокруг диска. Результаты, представленные в таблице 4,показывают, что штамм, выращенный на среде СПС(Турингин-Ф),обладает ярко выраженными антагонистическими свойствами в отношении 12 видов фитопатогенов Антагонистическая активность культуральной жидкости, полученной при росте штамма на среде ДПС, незначительная, или отсутствует. Таким образом,полученный выше перечисленными способами препарат Турингин-Ф (при содержании 1,5-3108 спор/мл) обладает комплексным действием против листогрызущих насекомых, стеблевых нематод и возбудителей корневых болезней растений. Таблица 1 Инсектицидная активность штамма В.20/3 при росте на соево-пшеничной среде (СПС) и дрожжеполисахаридной среде (ДПС) против личинок люцернового долгоносика на стадии 2-3 возраста Варианты опыта СПС (Турингин-Ф) ДПС Контроль вода Инсектицидная активность штамма В.20/3 при росте на соево-пшеничной среде (СПС) и дрожжеполисахаридной среде (ДПС) против личинок колорадского жука на стадии 2-3 возраста Варианты опыта СПС (Турингин-Ф) ДПС Контроль вода Таблица 3 Нематоцидная активность штамма 20/3 при росте на соево-пшеничной среде (СПС) и дрожжеполисахаридной среде (ДПС) против фитопаразитических нематодВарианты опыта СПС (Турингин-Ф) ДПС Контроль вода Таблица 4 Антагонистическая активность штамма В.20/3 при росте на соево- пшеничной среде (СПС) и дрожжеполисахаридной среде (ДПС) Тест - микроорганизмы СПС (Турингин-Ф) Зоны подавления роста тест-микроорганизма, мм 230,84201,6210,9221,1161,3170,84150,95201,1301,5481,3171,1140,9 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения бактериального препарата Турингин-Ф комплексного действия путем выращивания посевного материала (штамм.20/3) в питательной среде последовательно в колбах на качалке, в инокуляторах глубинного культивирования в ферментерах, отличающийся тем, что с целью получения препарата комплексного действия против листогрызущих насекомых, стеблевых нематод и возбудителей корневых болезней растений используют штамм. 20/3, который культивируют в питательной среде, содержащей соевую муку,пшеничную муку, глюкозу и минеральные соли при следующем соотношении ингредиентовсоевая мука - 1,0 пшеничная мука - 1,5 глюкоза - 0,6 О 4-0,1 СаС 2-0,15 2 НРО 4 - 0,15 (4)2 О 40,2 (4)2 О 4-0,2 -0,2 вода водопроводная остальной объем, пеногаситель - 0,1. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, при получении пастообразной формы препарата в качестве адсорбента и наполнителя используют бентонит.