Способ получения бактериального препарата “Нефтедеструктор-КазБио”

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ пресных и минерализованных вод) от загрязнения углеводородами нефти и нефтепродуктов. Техническим результатом является получение биопрепаратанефтедеструктора на основе высокоактивного аборигенного штаммаКД с разработанными оптимальными параметрами культивирования,включая источники питания, что повышает срок годности производимого продукта, а также получение высокоэффективного биопрепарата для широкого практического применения, снижение энерго-, ресурсо- и трудозатрат в процессе производства. Это достигается тем, что способ получения бактериального препарата, включающий глубинное культивирование штаммав условиях аэрации на питательной среде, согласно изобретению, наработку маточной культуры и культивирование штаммаКД в ферментерах осуществляют на минеральной питательной среде, содержащей сырую нефть.(72) Сатубалдин Калимжан КиньжабаевичСалангинас Людмила Алексеевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью КазЭкоБиоСистема Сатубалдин Калимжан Киньжабаевич Салангинас Людмила Алексеевна(74) Тусупова Меруерт Кырыкбаевна Дюсенов Еркебулан Рамазанович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НЕФТЕДЕСТРУКТОР-КАЗБИО(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к способам получения препаратов-нефтедеструкторов и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения бактериального препаратов-нефтедеструкторов и защиты окружающей среды (почвы, грунтов, нефтешламов, 29607 Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к способам получения препаратов-нефтедеструкторов и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения бактериальных препаратов-нефтедеструкторов и защиты окружающей среды (почвы, грунтов, нефтешламов,пресных и минерализованных вод) от загрязнения углеводородами нефти и нефтепродуктов. Проблема защиты окружающей среды от загрязнения ее нефтью и нефтепродуктами в условиях Казахстана особо актуальна, так как нефть в настоящее время является одним из основных загрязнителей природы, кроме того имеют место быть в больших масштабах и исторические захоронения в шламонакопителях. На практике применяют биопрепараты с целью разложения углеводородов нефти, такие как Путидойл, Деворойл, Родер. В Казахстане производится два биопрепарата - Биоден и Бакойл-, разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений. Углеводородокисляющая активность биопрепаратов, предназначенных для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, определяется не только их составом, но во многом зависит также от препаративной формы, в которой они предлагаются потребителю. Биопрепараты производятся в виде суспензий, эмульсий, паст, порошков. Каждая форма имеет свои достоинства и недостатки. В сухих биопрепаратах численность живых микроорганизмов ниже, чем в суспензии или пасте,так как для получения сухих форм применяется жесткая для живых организмов распылительная сушка,существенно ухудшающая качество биопрепаратов. Учитывая низкую численность выживающих после распылительной сушки микроорганизмов,авторы сухих форм биопрепаратов рекомендуют перед применением проводить активацию микроорганизмов, входящих в их состав, что не всегда возможно выполнить в полевых условиях и практически удваивает стоимость препарата, так как активация - это тот же процесс наработки биопрепарата в ферментере. Жидкие и пастообразные, как и сухие формы требуют активации, но у них короткий срок годности, в среднем от 7 дней до двух месяцев, что делает их малопривлекательными в промышленном применении. Известен способ получения препарата Путидойл на основе штамма бактерии 36. Препарат получают глубинным культивированием бактерии в питательной среде при 30 С в аэробных условиях с последующей распылительной сушкой либо лиофилизацией полученной культуральной жидкости / 1428809 А 1, 07.10.1988 г./. Недостатками данного аналога являются дороговизна процесса производства препарата за счет последней стадии его производства (сушка или лиофилизация) является очень дорогим. Известен способ получения препарата Деворойл. Препарат получают глубинным культивированием в питательной среде микроорганизмов, входящих в его состав, с последующим высушиванием полученной биомассы, при этом используется консорциум микроорганизмов. - 1500,-1501,-15020,-1972 ,. 2778 ,используемый для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем от загрязнения нефтепродуктами / 2023686 С 1, 30.11.1994 г./. Недостатками данного аналога являются различная таксономическая и видовая принадлежность микроорганизмов, требующей раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс производства препарата. При совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности,температурному оптимуму роста,возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных, и, соответственно, уменьшается эффективность такого препарата. Высушивание препарата существенно снижает эго эффективность и повышает себестоимость. Известен способ получения препарата Бакойл, изготовленного на основе консорциума аборигенных нефтеокислительных штаммов. Препарат для очистки почв от нефти и нефтепродуктов включает аэробные нефтеокисляющие бактерии и адсорбенты, в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит ассоциацию бактериальных штаммов 40 и 34,7 А, адсорбированную на бентоните / 24879 А 4,15.11.2011 г./. Недостатками данного аналога являются различная таксономическая и видовая принадлежность микроорганизмов, требующей раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс производства препарата. При совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности,температурному оптимуму роста,возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных, и, соответственно, уменьшается эффективность такого препарата. Высушивание препарата существенно снижает эго эффективность и повышает себестоимость. Кроме того, у данных препаратов очень короткий срок реализации - 7 суток,что существенно ограничивает их масштабное внедрение. Известен способ получения препарата Биоден,изготовленного на основе консорциума аборигенных нефтеокислительных штаммов. Способ получения препарата деградирующего нефть путем глубинного культивирования консорциума микроорганизмов разных видов в условиях аэрации на питательной среде,концентрирования полученной культуральной жидкости центрифугированием и распылительной сушкой, в котором в состав питательной среды входят рыбная мука и кормовые дрожжи, используются совместное культивирование всех четырех штаммов при получении посевного материала и получении биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов, а для накопления биомассы используют аборигенные штаммы бактерий 69,Кл 1,УД 6-4,. 3 / 25929 4, 15.08.2012 г./. Недостатками данного аналога являются различная таксономическая и видовая принадлежность микроорганизмов, требующая раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс производства препарата. При совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности,температурному оптимуму роста,возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных, и, соответственно, уменьшается эффективность такого препарата. Высушивание препарата существенно снижает эго эффективность и повышает себестоимость. Кроме того, у данных препаратов очень короткий срок реализации - 7 суток,что существенно ограничивает их масштабное внедрение. Известен способ получения препарата Родер,выбранный в качестве наиболее близкого аналога,включающий глубинное культивирование штаммовАс-1514 Д и-1513 Д в условиях аэрации на питательной среде. На начальной стадии культивирование осуществляют раздельно, на втором этапе - совместное. При этом процесс ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника азота и других органических веществ дрожжевой автолизат или рыбный гидролизат. Полученную в ферментере биомассу концентрируют, стабилизируют и необязательно высушивают / 2174496 С 2, 10.10.2001 г./. Недостатками данного аналога являются дорогая питательная среда и раздельное культивирование на первом этапе наращивания биомассы. Задачей изобретения является разработка способа получения бактериального препарата Нефтедеструктор-КазБио за счет использования более дешевых источников питания для микроорганизмов, как на лабораторном этапе получения маточной культуры, так и на промышленном этапе. Технология производства должна обеспечивать получение продукта со сроком реализации, обеспечивающим его промышленное применение, не менее 6 месяцев. Техническим результатом является получение биопрепаратанефтедеструктора на основе высокоактивного аборигенного штаммаКД с разработанными оптимальными параметрами культивирования,включая источники питания, что повышает срок годности производимого продукта, а также получение высокоэффективного биопрепарата для широкого практического применения, снижение энерго-, ресурсо- и трудозатрат в процессе производства. Это достигается тем, что способ получения бактериального препарата, включающий глубинное культивирование штаммав условиях аэрации на питательной среде, согласно изобретению, наработку маточной культуры и культивирование штаммаКД в ферментерах осуществляют на минеральной питательной среде, содержащей сырую нефть. Культивирование штамма КД осуществляют до титра 107-109 кл/мл. Полунепрерывное культивирование обеспечивает высокую производительность ферментера. Образовавшиеся кокковые клетки в питательной среде длительное время сохраняют свои специфические свойства - более 3-х лет, что существенно увеличивает сроки годности готового препарата. Штамм КД предназначен для использования на биологическом этапе рекультивационных работ нефтезагрязненных объектов. Штамм растет на жидких и агаризированных средах (МПА, АГВ, картофельный агар). Оптимальная температура роста - 28 С,длительность культивирования - 24-48 ч. Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода. Хорошо утилизирует фруктозу, сорбит,манит, инозит, слабее глюкозу, сахарозу, мальтозу,сукцинат, цитрат, и бензоат, активно разлагает тирозин. По систематическому положению относится к группе нокардиоформных актиномицетов к подгруппе бактерий, содержащих миколовые кислоты. Макроскопически колонии микроорганизма круглые, непрозрачные, слизистые,плоские, вершина приподнята, края ровные, окраска кремовато-розовая. При микроскопическом исследовании культура представлена палочковидными, неравномерными по толщине грамположительными клетками, споры отсутствуют. В молодой культуре палочки проявляют склонность к ветвлению (образование примитивного мицелия),диаметр клеток 0,6-0,8 мк, длина в среднем составляет 4-8 мк, в случае примитивного мицелия до 10-12 мк. Цикл развития хорошо выражен, на ранних стадиях (20-24 часа) наблюдается элементарное ветвление, в дальнейшем (3-4 сутки) происходит распад длинных клеток на палочковидные и кокковидные элементы. Депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов с коллекционным номером ВКПМ АС-1661. Препарат, изготовленный на основе этого штамма по степени воздействия на организм в соответствии с гигиенической классификацией 3 бакпрепаратов относится к веществам 4-го класса опасности,малотоксичен для человека и теплокровных животных, практически не опасен для пчел и полезных насекомых, не фитотоксичен. Изобретение осуществляется следующим образом. Настоящее изобретение поясняется конкретным примером, который наглядно демонстрирует возможность достижения приведенной совокупностью признаков требуемого технического результата, однако не является единственно возможным. Пример. Способ получения препарата НефтедеструкторКазБио на основе штаммаКД включает два этапа. Особенность способа заключается в том, что на начальном этапе его осуществления проводят глубинное культивирование в стерильных лабораторных условиях в колбах на селективной среде, а на втором этапе проводят глубинное культивирование, предварительно выращенного в лабораторных условиях штамма, на той же питательной среде в физиологически оптимальном режиме культивирования. Выращивание микроорганизмов на обоих этапах проводят на одной и той же питательной минеральной среде,содержащей сырую нефть, как единственный источник углерода. Работу с чистыми культурами микроорганизмов производят в специальных боксах с соблюдением правил асептики. Маточная культураКД выращивается и хранится на скошенных МПА с периодическими пересевами(один раз в три месяца). Инкубирование в термостате при температуре 28 С в течение 48 ч. Хранение маточной культуры - при температуре 25 С, перед пересевом - обязательная проверка на отсутствие посторонней микрофлоры. Биомассу штамма микроорганизмаКД, полученную на твердой среде,переносят в жидкую среду следующего состава, на 1 л воды калий азотнокислый (3) - 1 г калий фосфорнокислый однозамещенный (Н 2 РО 4) - 1 г калий фосфорнокислый двухзамещенный(СаС 2) - 0,02 г, нефть сырая - 2,7,0-7,2. Штамм культивируют на качалке при температуре 28-32 С в течение 48 ч до полной деструкции нефти. Полученный посевной материал используют для стартового культивирования. Для этого в подготовленные ферментационные машины с аналогичной растворенной питательной средой(комплекс микро- и макроэлементов растворяют в воде при температуре 15-25 С, перемешивают до полного растворения. Измеряют температуру ираствора, при необходимости корректируют до 7,0-7,2 20-ным раствором щелочизагружают нефть сырец в количестве 2, посевной материал в количестве 2 от объема питательной среды. Герметично закрывают ферментер,включают мешалку, компрессор для подачи воздуха и ведут культивирование. Культивирование ведут при температуре 15-25 С в течение 24 ч при аэрации и избыточном давлении на аппарате 0,02-0,03 МПа,воздух податся из расчта 0,4 м 3/мин на 1 м 3 культуральной жидкости. Окончанием стартового периода культивирования является полная деструкция нефти. Во время стартового периода определяют температуру икультуральной жидкости - каждые 3 часа, деструкцию нефти - через 12 часов от начала культивирования и далее через каждые 1-3 часа. По окончании стартового периода ведут полунепрерывное культивирование при перемешивании и аэрации в соответствии с заданным режимом культивирования. Готовый препарат Нефтедеструктор-КазБио представляет собой концентрат живых клеток штаммаКД с титром 1107 1109 микробных клеток в мл от светло-коричневого до темно-коричневого цвета с запахом нефти,расфасованный в пластиковые емкости от 1,0 литра до 1000 литров. Предлагаемый способ позволяет получить высокоэффективный препарат в жидкой форме с численностью активных углеводородокисляющих клеток 107-109 кл/мл. со сроком годности не менее 6 месяцев с низкой себестоимостью. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения бактериального препарата Нефтедеструктор-КазБио,включающий глубинное культивирование штаммав условиях аэрации на питательной среде, отличающийся тем, что наработку маточной культуры и культивирование штаммаКД в ферментерах осуществляют на минеральной питательной среде, содержащей сырую нефть. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование штаммаКД осуществляют до титра 107-109 кл/мл.