Способ оценки генетической предрасположенности и прогнозирования развития лактозной непереносимости среди казахского населения

(51) 01 33/48 (2009.01) 12 1/68 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Акильжанова Айнур Рахметуловна Нышанбеккызы Багдат Момыналиев Куват Темиргалиевич Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. В.В. Меньшикова. М, 1987, с. 224(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЛАКТОЗНОЙ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ СРЕДИ КАЗАХСКОГО НАСЕЛЕНИЯ(57) Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к гастроэнтерологии, а именно к оценке генетической предрасположенности и прогнозированию развития лактозной непереносимости. Способ обеспечивает определение генетической предрасположенности и оценки развития лактозной непереносимости,проведение дифференциальной диагностики синдрома мальабсорбции,врожденных наследственных и приобретенных форм лактозной непереносимости. Целью настоящего исследования является оценка генетической предрасположенности и прогнозирование развития лактозной непереносимости среди лиц казахской популяции. Цель достигается тем,что проводят фенотипический тест на толерантность к лактозе, а также генетические исследования полиморфизмов гена лактазы , при этом оценивают полиморфизм 13910 С/Т данного гена. При выявлении гомозиготного нормального варианта полиморфизма С/С прогнозируют развитие непереносимости лактозы у взрослых, при выявлении гетерозиготного варианта С/Т промежуточную форму, и при выявлении гомозиготного мутантного варианта Т/Т - хорошую переносимость лактозы у взрослых. Применение данного способа позволит оценить генетическую предрасположенность к лактозной непереносимости, прогнозировать возможность развития данного состояния,проводить дифференциальную диагностику синдрома мальабсорбции. Это даст возможность практическим врачам выбрать более адекватную тактику ведения больных, разработать коррекцию диеты. Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к гастроэнтерологии, а именно к оценке генетической предрасположенности и прогнозированию развития лактозной непереносимости. Способ обеспечивает определение генетической предрасположенности и оценки развития лактозной непереносимости,проведение дифференциальной диагностики синдрома мальабсорбции,врожденных наследственных и приобретенных форм лактозной непереносимости. Непереносимость лактозы(лактозная недостаточность, лактозная мальабсорбция) - это одна из наиболее широко распространенных форм интестинальных энзимопатий,обусловленная наследственным, врожденным или приобретенным снижением активности кишечной лактазы Изачик Ю.А. Синдром мальабсорбции у детей. М., 1991 с. 215-217. Ген, кодирующий синтез лактазы,локализован во 2-й хромосоме, способность расщеплять лактозу передается по аутосомнодоминантному типу с высокой пенетрантностью, а мальдигестия - по аутосомно-рецессивному типу Изачик Ю.А. Синдром мальабсорбции у детей. М.,1991 с. 215 - 217, Колб В.Г., Камышников Справочник по клинической химии, 2-е изд.,перераб. и дополн. Минск, 1982 с. 100 - 102 Все методы лабораторной диагностики мальдигестии лактозы могут быть разделены на две группы прямые и косвенные Колб В.Г.,Камышников Справочник по клинической химии, 2-е изд., перераб. и дополн. Минск, 1982 с. 100 - 102, Лабораторные методы исследования в клинике. /Под ред. В.В. Меньшикова/М., 1987 с 224. К прямым методам относят биопсию тонкого кишечника с последующей гистохимической идентификацией лактазы щеточной каймы энтероцитов. Этот метод является наиболее достоверным и используется как эталон для оценки диагностической значимости других методов. Однако ввиду возможности травматизации слизистой оболочки, риска инфицирования ВИЧ - и НВ-инфекцией этот метод малоприменим для скрининга общей популяции. К косвенным методам оценки лактозной недостаточности относится копрологическийанализ обнаружение увеличения содержания крахмала,клетчатки в кале, снижение рН кала менее 5,5. Проба Бенедикта. С помощью этого анализа выявляется наличие сахара в моче. К нескольким каплям испытуемого раствора добавляется раствор Бенедикта, приготовленный из цитрата натрия или калия, карбоната натрия и сульфата меди. Смесь кипятится и встряхивается примерно в течение двух минут, а затем оставляется для остывания. Если глюкозы больше 2, то образуется красноватый,желтоватый или зеленоватый осадок, причем более высокое процентное содержащие глюкозы приводит к выпадению красного,а незначительное содержание глюкозы (около 0,05) - зеленого осадка. В норме содержание глюкозы в моче не должно превышать 0,25 у детей до 12 месяцев и быть отрицательным после одного года. 2 Водородный дыхательный тест. Позволяет определять концентрацию водорода в выдыхаемом воздухе до и после нагрузки лактозой (назначается от 0,5-1 г/кг до 12-25 г лактозы). Неполностью всосавшиеся в тонкой кишке углеводы достигают толстой кишки, где расщепляются анаэробной микрофлорой, часть образовавшегося при этом водорода переходит в кровь и достигает легочного русла, затем переходит в альвеолярный и вдыхаемый воздух,где и может быть зарегистрирован. У больных с лактазной недостаточностью регистрируется значительное увеличение содержания водорода (более 15-20 рр),что связано с усиленным бактериальным расщеплением лактозы в толстой кишке. Ложнопозитивные результаты отмечаются у 20 пациентов. Указанные методы являются трудоемкими,требуют дополнительного оборудования(дыхательный тест) и применяются в настоящее время по принципу клинических показаний к комплексному лабораторному обследованию. Скринирующих методов,определяющих генетическую предрасположенность к лактозной непереносимости в казахской популяции, не описано. Данных о проведении генетических исследований при лактозной непереносимости среди населения в Казахстане нет. Известен способ определения лактозной непереносимости по оценке переваривания лактозы- тест на толерантность к лактозе (фенотипический тест) Лабораторные методы исследования в клинике. /Под ред. В.В. Меньшикова/. М., 1987 с. 224. Пробу на толерантность к лактозе проводят для определения уровня глюкозы в плазме крови после нагрузки лактозой (50 г на 400 мл воды, детям раствор лактозы дают из расчета 50 г на 1 м поверхности тела). Если уровень глюкозы после нагрузки лактозой повышается менее чем на 20 мг/дл (СИ менее 1,1 ммоль/л), значит, у пациента имеется непереносимость лактозы. Об этом свидетельствует также кислая реакция кала, рН которого меньше 5,5, и высокое содержание в нем глюкозы. Клинические симптомы, появляющиеся после нагрузки лактозой, лишь указывают на возможность недостаточности лактазы, но не подтверждают ее, так как могут наблюдаться и при нормальной активности лактазы после нагрузки лактозой. При отсутствии или недостаточности лактазы (В-галактозидаза) принятая внутрь лактоза остается в кишечнике, вызывая коликообразные боли в животе и диарею. Недостатком этого метода является то, что он выявляет имеющуюся лактозную непереносимость,но не позволяет прогнозировать возможность развития данного состояния и проводить дифференциальную диагностику синдрома мальабсорбции, врожденных наследственных и приобретенных форм лактазной недостаточности. Применение данного метода оценки лактозной недостаточности недостаточно информативно,неприятно для пациентов в применении, требует дополнительной подготовки (воздержание от приема пищи и тяжелой физической нагрузки в течение 8 ч до исследования). Целью настоящего исследования является оценка генетической предрасположенности и прогнозирование развития лактозной непереносимости среди лиц казахской популяции. Цель достигается тем,что проводят фенотипический тест на толерантность к лактозе, а также генетические исследования полиморфизмов гена лактазы , оценивают полиморфизм 13910 С/Т гена лактазы . При выявлении гомозиготного нормального варианта полиморфизма С/С прогнозируют развитие непереносимости лактозы у взрослых, при выявлении гетерозиготного варианта С/Т промежуточную форму, и при выявлении гомозиготного мутантного варианта Т/Т - хорошую переносимость лактозы у взрослых. Способ осуществляется следующим образом. Фенотипический тест на толерантность к лактозе проводится аналогично, как в прототипе. Оценка генетической предрасположенности к лактозной непереносимости. Фрагмент ДНК,содержащий полиморфизм С/Т-13910,был амплифицирован с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и затем просеквенирован. Для ПЦР амплификации были разработаны и сконструированы праймеры 5-3 (прямой) и 5-3 (непрямой). ПЦР продукты были разделены на 1.5 агарозном геле с бромистым этидием для визуализации. Избыток праймеров был очищен с помощью переваривания 2.5 ед щелочной фосфатазы и 5 ед Экзонуклеазы при 37 в течение 45 мин с последующей инактивацией при 80 С в течение 15 мин. Реакцию секвенирования проводили с использованием набора реактивов 3.1( , США) при следующих условиях 96 С 1 мин, затем 30 циклов 96 10 с, 57 30 с, 72 1 мин, с последующей очисткой спиртацетатным методом. Секвенирование проводили в ДНК анализаторе 37301( , США). Анализ сиквенс результатов проводили с помощью программы 5.7 ( , США). Варианты заключения С/С - нормальный вариант полиморфизма, связанный с непереносимостью лактозы у взрослых, в гомозиготной форме С/Т гетерозиготная форма полиморфизма Т/Т мутантный вариант полиморфизма, связанный с хорошей переносимостью лактозы у взрослых, в гомозиготной форме. С использованием предлагаемого нами способа была оценена генетическая предрасположенность к развитию лактозной непереносимости у 187 добровольцев студентов казахской национальности,средний возраст 22,16,9 лет. После подписания информированного согласия на участие в исследовании всем проводился фенотипический тест толерантности к лактозе, оценивались клинические проявления лактозной непереносимости и уровень нарастания глюкозы в крови через час после нагрузки лактозой с использованием глюкометра ( , Германия). Уровень глюкозы,регистрируемый до и после нагрузки лактозой,отражает суммарный результат расщепления и всасывания лактозы. У людей с лактазной устойчивостью в течение 1-2 часов после приема лактозы (50 г) уровень глюкозы в крови повышается. По результатам фенотипического теста участников разделяли на три категории лактозная непереносимость -нарастание уровня глюкозы менее 1.1 ммоль/л, промежуточная форма (переносит в малом количестве) - 1.1-1.7 ммоль/л, лактозная переносимость - нарастание уровня глюкозы более 1.7 ммоль/л. Для выделения геномной ДНК были взяты образцы слюны с эпителиальными клетками внутренней части щеки (буккальные клетки) с помощью специальных палочек. Геномная ДНК была выделена из буккальных клеток всех участников исследования, используя( ,) в соответствии с протоколами производителя. Генотипирование полиморфизма 13910 С/Т гена лактазыпроводили методом прямого секвенирования с использованием сконструированных праймеров. Результаты представлены в таблице. Таблица Результаты генотипирования полиморфизма 13910 С/Т гена лактазыу 187 студентов добровольцев казахской национальности в зависимости от фенотипа Генотип 139 ЮС/Т гена лактазыС/С С/Т Т/Т Всего Лактозная непереносимость Промежуточная форма Лактозная переносимость У большей части участников исследования выявлен гомозиготный нормальный вариант С/С полиморфизма 68,5. При проведении теста толерантности к лактозе у них были выявлены клинические симптомы лактозной непереносимости(диарея - 47, метеоризм 51,8), нарастание уровня глюкозы отмечалось менее 1.1 ммоль/л.(клинические признаки лактазной непереносимости наблюдались у 8 обследованных, нарастание уровня глюкозы в крови -1.1 - 1.7 ммоль/л), и гомозиготный мутантный вариант Т/Т выявлен у 3,7 обследованных студентов. У них не наблюдались клинические признаки лактозной непереносимости, уровень глюкозы повысился более чем на 1.7 ммоль/л, что свидетельствует о хорошей переносимости лактозы у взрослых. Отмечается корреляция генотипов 13910 С/Т гена лактазыс фенотипическими формами(лактозная непереносимость, промежуточная форма и переносимость). Таким образом, генотипирование полиморфизма 13910 С/Т гена лактазыпозволяет прогнозировать развитие лактозной непереносимости у взрослого казахского населения. Примеры конкретного применения Способ оценки генетической предрасположенности и прогнозирования развития лактозной непереносимости среди казахского населения Участник 138. Фенотипический тест уровень глюкозы натощак 6,1 ммоль/л, после нагрузки лактозой (50 г на 400 мл воды) через 1 час - 6,4 ммоль/л, нарастание уровня глюкозы 0,3 ммоль/л. Клинически наблюдались колики в животе, метеоризм. При генотипировании полиморфизма 13910 С/Т гена лактазывыявлен гомозиготный вариант С/С, прогнозирующий развитие непереносимости лактозы у взрослых, что и коррелирует с данными фенотипического теста. Участник 15. Фенотипический тест уровень глюкозы натощак 5,5 ммоль/л, после нагрузки лактозой (50 г на 400 мл воды) через 1 час - 5,9 ммоль/л, нарастание уровня глюкозы 1,5 ммоль/л. Клинические проявления не наблюдались. При генотипировании полиморфизма 13910 С/Т гена лактазывыявлен гетерозиготный вариант С/Т, ассоциированный с промежуточной формой непереносимости лактозы у взрослых, что и коррелирует с данными фенотипического теста. Участник 147. Фенотипический тест уровень глюкозы натощак 5,7 ммоль/л, после нагрузки лактозой (50 г на 400 мл воды) через 1 час - 7,6 ммоль/л, нарастание уровня глюкозы 1,9 ммоль/л. Клинические проявления не наблюдались. При генотипировании полиморфизма 13910 С/Т гена лактазывыявлен мутантный вариант Т/Т,ассоциированный с хорошей переносимостью лактозы. Таким образом, проведя только генотипирование полиморфизма 13910 С/Т гена лактазыможно оценить генетическую предрасположенность к лактозной непереносимости,прогнозировать возможность развития данного состояния у здоровых лиц. Технико-экономическая эффективность способа. Применение данного способа позволит оценить генетическую предрасположенность к лактозной непереносимости, прогнозировать возможность развития данного состояния,проводить дифференциальную диагностику синдрома мальабсорбции. Это даст возможность практическим врачам выбрать более адекватную тактику ведения больных, разработать коррекцию диеты. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки генетической предрасположенности и прогнозирования развития лактозной непереносимости среди казахского населения путем проведения фенотипического теста на толерантность к лактозе, отличающийся тем,что дополнительно проводят генетическое исследование полиморфизма в гене лактазы ,при этом определяют полиморфизм 13910 С/Т данного гена и при выявлении гомозиготного нормального варианта полиморфизма С/С прогнозируют развитие непереносимости лактозы у взрослых, при выявлении гетерозиготного варианта С/Т - промежуточную форму, и при выявлении гомозиготного мутантного варианта Т/Т - хорошую переносимость лактозы у взрослых.