Способ дифференциальной диагностики ревматоидного и реактивного артритов у детей

(51) 01 33/49 (2009.01) 01 33/531 (2009.01) 01 33/564 (2009.01) 01 33/68 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ иммунологического исследования сыворотки крови у детей. Разработанный нами способ дифференциальной диагностики ревматоидного и реактивного артритов,отличается тем, что с целью дифференциации ЮРА и РеА в активной фазе болезни определяют концентрацию хрящевого гликопротеина -40 в крови и при его уровне 112 мг/л и выше определяют ЮРА, ниже 112 мг/л - РеА.-40-испытание является иммуноферментным анализом в формате микротитерных полосок. Фрагмент моноклональных анти- -40 антител присоединяется до стриптовидина на полоске и захватывает -40 в стандарте, контроле или образце. Деятельность фермента защищается с -нитрофенил фосфатом,как субстратом. Показатели уровня -40 в крови в группе с ЮРА были выше по сравнению с группой с РеА с уровнем достоверности различий - р 0,01 (по критерию Стьюдента,однофакторному дисперсионному анализу).(72) Отарбаев Нуржан Курмангалиевич Мукушева Зауре Серикпаевна Уразалина Жибек Нурланбековна Молдатаев Нуржан Жандарбекович(73) Акционерное общество Национальный научный центр материнства и детства(56) Карякина Е.В. Жаденов И.И. Гликозаминогликаны сыворотки крови и синовиальной жидкости,как показатель воспалительно-деструктивного процесса при ревматоидном артрите // Саратов, 1986 , с. 4-6(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО И РЕАКТИВНОГО АРТРИТОВ У ДЕТЕЙ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии в педиатрии. Задачей изобретения является дифференциальная оценка реактивного и ревматоидного артрита и активности воспалительного процесса путем Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии в педиатрии, и предназначено для дифференциальной оценки реактивного и ревматоидного артрита и активности воспалительного процесса путем иммунологического исследования сыворотки крови. Одной из актуальных проблем современной детской ревматологии является дифференциальная диагностика хронических воспалительных заболеваний суставов у детей. В 1997 году педиатрическим субкомитетом(Международная лига ревматологических ассоциаций) классификационные аспекты были модифицированы, объединив под этим названием все артриты детского возраста,имеющие хроническое течение ( ., 1997,., 1998, , 2000). Вопрос дифференциальной диагностики реактивного артрита (РеА) и ювенильного ревматоидного артрита (ЮРА) в его дебюте, остается одним из самых актуальных в детской артрологии, в виду необходимости своевременной постановки диагноза и назначения базисной терапии. В патогенезе ранних стадий ЮРА преобладающее значение имеет Т-клеточномакрофагальный механизм с цитокиновым каскадом, в то время как на поздних стадиях доминируют автономные неиммунные механизмы на основе взаимодействия генотипически измененных синовиоцитов с компонентами внеклеточного матрикса. Отсюда вытекает вывод о возможности и необходимости ранних терапевтических воздействий с целью приостановления патологического процесса на неинвазивной относительно хряща стадии(Яременко О. Б. Клинико-патогенетическая гетерогенность и пути оптимизации лечения ревматоидного артрита и системной красной волчанки значения изменений кислородного обеспечения тканей и вызывающих его процессов Дис. д-ра мед. наук 14.01.12 / Национальный медицинский ун-т им. О.О.Богомольца. - К., 1999. 432 л. - Библиогр. л. 319-400,). Таким образом,поиск новых маркеров дифференциальной диагностики артритов у детей послужил основанием для настоящего исследования. В последнее время в литературе указывается роль биологических маркеров в диагностике различных заболеваний. Представляет интерес хрящевой гликопротеин 40, впервые выделенный из дифференцирующихся гладкомышечных клеток, затем из секретов молочных желз коров в период перед лактацией. . 1993 32 949-955). Позже была показана его экспрессия в человеческих синовиальных клетках, человеческих и свиных хондроцитах. Белок имеет несколько названий НС 39 (39- человеческий хрящевой гликопротеин с молекулярной массой 39 ),31 (-3- 1, хитиназоподобный белок 1), -40 (назван так по первым трм аминокислотам- тирозин, К - лизин,- лейцин). Проводилось изучение -40 в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите у взрослых,как показатель активности воспалительного процесса ( В ,РА ,,О ,,,,... 1998 110(4)351-60). Роль этого полипептида в диагностике и дифференциальной диагностике артритов у детей ранее не изучалась. Известны способы диагностики активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем определения в сыворотке крови серомукоида (Лемперт М.Д. Биохимические методы исследования. Кишенев, 1968 г.), сиаловых кислот(Лабораторные методы исследования в клинике Справочник/ Под ред. Меньшикова В.В. М. Медицина, 1987, .368), протеинограммы (Сигидин Я. А. Гусева Н.Г. Иванова М.М. Диффузные болезни соединительной ткани. Руководство для врачей. М. Медицина, 1994. .544) и др. Указанные способы не определяют специфичность воспалительного процесса для реактивного и ревматоидного артрита. Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является способ определения наличия активности воспалительно-деструктивного процесса при ревматоидном артрите путем определения в сыворотке крови уровня метаболитов соединительной ткани - гликозаминогликанов(Карякина Е.В. Жаденов И.И. Гликозаминогликаны сыворотки крови и синовиальной жидкости, как показатель воспалительно-деструктивного процесса при ревматоидном артрите // Саратов, 1986 г. с. 4-6 ) Способ включает протеолиз сыворотки крови папаином,последующую инкубацию,депротеинизацию, получение безбелковой пробы центрифугированием,поэтапное осаждение,очистку пробы и определение ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 523 нм. По оптической плотности рассчитывают количественное содержание гликозаминогликанов и при значении его больше 0,78 г-10 /л диагностируют наличие воспалительно-деструктивного процесса. Недостатком известного способа является его длительность, многоэтапность, необходимость в импортных дорогостоящих реактивах. Исследование занимает 3 суток, при этом диагностируемый воспалительно-деструктивный процесс не может свидетельствовать о конкретной нозологии. Задачей изобретения является разработка способа ранней дифференциальной диагностики реактивного и ювенильного ревматоидного артрита у детей. Принципы процедуры-40 испытание является иммуноферментным анализом в формате микротитерных полосок. Фрагмент моноклональных анти- -40 антител присоединяется до стриптовидина на полоске и захватывает -40 в стандарте, контроле или образце. Деятельность фермента защищается с -нитрофенил фосфатом,как субстратом. Материалом исследования явились образцы крови 40 детей в возрасте от 2 до 16 лет с артритами, из них 20 с РеА, 20 с ЮРА. Критерии включения Достоверные диагнозы РеА или ЮРА по критериям Возраст пациентов не старше 16 лет Наличие активного суставного синдрома Исследование было направлено на определение содержания в крови -40. Обнаружение -40 проводилось по протоколу иммуноферментного анализа соответственно руководству фирмы производителя реактива(Германия). Для исследования использовалась сыворотка крови,статистическая обработка проводилась по программе БИОСТАТ (Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М. Практика, 1966. - 459 с). Количественное соотношение детей целенаправленно было одинаковым, половое соотношение в исследованных группах не имело достоверных отличий. Возрастной состав был примерно одинаковым. Среднее число припухших суставов преобладало в группе с ЮРА. При этом среднее значение СОЭ было выше в группе с РеА. Положительные пробы на ревматоидный фактор (РФ) выявлена только в группе ЮРА. Таблица 1 Общая характеристика обследованных детей Число детей (мальчики/девочки) Средний возраст Среднее число поражнных суставов Среднее СОЭ Идентификация РФ Полученные результаты по иследованию уровня-40 в крови статистически обработаны, данные отображены на диаграмме 1 Диаграмма 1 Значение уровня -40 в сравниваемых группах Показатели уровня -40 в крови в группе с ЮРА были выше по сравнению с группой с РеА с уровнем достоверности различий - р 0,01 (по критерию Стьюдента,однофакторному дисперсионному анализу). Таким образом, содержание -40 112 мг/л и выше свидетельствует о ЮРА, ниже о РеА. Клинический пример Больная Б., 1 год, 6 мес, История болезни 3226 ПБ, ПредварительныйЮвенильный артрит. Поступила в кардиоревматологическое отделение ННЦМД с жалобами на отек, гиперемию,гипертермию обоих коленных суставов. Из анамнеза со слов мамы ребенок болен в течении 1 месяца, с появлением вышеуказанных жалоб. Ребенок, накануне этого переболел острой респираторной инфекцией, лечился и обследовался в поликлиническом порядке, был назначен антибиотик макропен, амбулаторно принимали неполных 2-3 дня. После улучшения отменили самостоятельно, после чего спустя 2-4 дня заметили припухлость правого коленного сустава - местно накладывали компресс спиртовой на одуванчиках, с временным улучшением, спустя неделю снова 3 произошло обострение, а после этого и присоединение и левого коленного сустава в воспалительный процесс, при этом походка не нарушается. В этот момент влейкоциты 7,9109 тыс., снижение гемоглобина до 105 г/л,СОЭ 3 мм/час. Ребенок поступает в отделение кардиоревматологии АО ННЦМД отделения кардиологии для стационарного обследования с целью верификации диагноза и лечения. Объективно состояние средней степени тяжести, за счет выраженного суставного синдрома,выраженного беспокойства ребенка во время осмотра. Самочувствие во время осмотра страдает умеренно. Астеничного телосложения, несколько пониженного питания. Периферические лимфоузлы пальпируются обычных размеров, не увеличены,б/б, не спаяны с подлежащей тканью. Зев спокоен,периферические л/у пальпируются до 0,5 см в диаметре, б/б. Кожные покровы чистые, светлые Видимые слизистые розовые, чистые. Дыхание через нос свободное. В легких дыхание проводится по всем полям, хрипов нет. Область сердца визуально не изменена, границы верхняя по 2 ребро слева, правая по правой парастернальной линии,левая по левой срединоключичной линии на 0,5 см кнаружи. ЧСС 146 ребенок во время осмотра кричит, тахикардия. Деятельность ритмичная, тоны ясные. Аускультативно систолический шум на верхушке сердца. Живот мягкий, б/б при глубокой пальпации. Печень 0,5 см,эластичной консистенции, б/б. Селезенка не пальпируется. Мочеиспускание свободное, б/б. Стул оформленный 1 раз в день. Мочеиспускание свободное, б/б. Локальный статус Визуально отмечается припухлость обоих коленных суставов, 25162 визуализируется скопление жидкости в заворотах надколенника. Сгибание и разгибание в левом и правом коленных суставах несколько ограничено,осмотр при этом несколько затруднен. Ребенок ходит самостоятельно, не прихрамывает, в течение дня активен. Другие суставы не изменены. В обследовании 1.от 27.11 Нв 126 г/л, лейкоциты 12109,тромб 376109 тыс, лимф 46, сегментоядерные 44, моноциты - 7, СОЭ 38 мм/час 2. ОАМ от 27.11 прозрачная, белок - отр.,эпителий 2-4 в п/зр, лейк 5-6 в п/зр, эритр 1-2 в п/зр,слизь 3. БХ крови - об/белок -73 г/л, РФ 14,9, АЛТ 16,27 ед/л,40 ед/л, креатинин, мочевина 3,29 ммоль/л, сыв.железо 5,10 мкмоль/л, натрий 140 ммоль/л, калий 5,4 ммоль/л, хлориды 106 ммоль/л 4. ИФА на , АНСА-отрицательно,Ревматоидный фактор - 14,9 ед./мл (серопозитив сомнительный). 5. ИФА на внутриклеточный инфекции-отрицат.,-110 положительный. 6. Реакция Райта - отрицательно 7. РПГА с кишечной группой - псевдотуб.,иерсиниозным а/г - отрицательно 8. ЭКГ от 27.11 Ритм синусовый с ЧСС 160 в мин. На фоне выраженного беспокойства и крика ребенка. ЭОС не отклонена. 9. ДЭХОКГ - Открытое овальное окно 3 мм. Полости сердца не расширены и толщина его стенок в норме. ДХЛЖ. РСДЛА 28-30 мм.рт.ст 10.УЗИ ОБП и почек - Структурных изменений не выявлено 11.УЗИ коленных суставов - Синовит с выпотом 1 стадия. 12.Консультация Лор врача - здорова 13.Консультация стоматолога - здорова 14.Мазок из зева на бак/посев и чувствительность к а/б-высев .-3105 15.Рентген коленных суставов-Я-признаки синовита. Также с целью дифференциальной диагностики реактивного и дебюта ревматоидного артрита пациентка была обследована по предложенному способу, выявлен уровеньв крови 191 мг/л,после чего был выставлен клинический диагноз Ювенильный ревматоидный артрит,олигоартикулярный вариант,медленнопрогрессирующее течение, активностьстепени,ФСстепени. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ дифференциальной диагностики ревматоидного и реактивного артритов у детей,включающий исследование крови методом ИФА,отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию хрящевого гликопротеина -40 и при его уровне 112 мг/л и выше выставляют диагноз ювенильный ревматоидный артрит,ниже 112 мг/л диагностируют реактивный артрит.