Пробиотический комплекс для лечения и профилактики пародонтита

(51) 61 35/74 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Данный пробиотический комплекс обладает лечебным действием при деструктивновоспалительных заболеваниях ротовой полости человека. Созданный на основе биологически активных моноштаммов лактобацилл и желантина данный пробиотический комплекс обладает рядом биологических свойств, которые конкурируют с целым рядом лекарственных средств антибактериальной направленности. Комплекс обладает антилизоцимной, адгезивной активностями, устойчив к ряду антибиотиков. Зоны угнетения роста тест-организмов, мм. 18,00,9, .15,00,0, .15,60,6, .9,00,0, .19,30,6, . 19,60,3,18,00,9. Пробиотический комплекс рекомендуется использовать в терапевтического средства для лечения и профилактики ларадонтитов.(72) Туякова Алтынай Камидоллаевна Садуахасова Сауле Абдуахаповна Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна Шахабаева Гульнар Сакеновна Абжалелов Ахан Бегманович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Воложин А.И., Ильин В.К. и др. Разработка и применение пародонтальной повязки из коллагена и суспензии клеток 37 в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта // Стоматология двухмесячный научнопрактический журнал, 2004, т.83,6, с.6-8(54) ПРОБИОТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ПАРОДОНТИТА Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Изобретение представляет собой пробиотический комплекс в виде желатиновых пластинок(стрипов) с иммобилизованными пробиотическими микроорганизмами (,), данные стрипы предназначены для лечения и профилатики пародонтита. Аналог изобретения. Из известных препаратов наиболее близким является пародонтальная повязка,состоящая из коллагена и суспензии клеток 37. Эффективность использованного средства объясняется существенным снижением количества и частоты выделения из пародонтальных карманов представителей агрессивных видов микробов(пигментообразующих бактероидов, актиномицетов и. ),также дрожжеподобных грибов. Предлагаемая пародонтальная повязка обеспечивает ремиссию длительностью до 10-12 месяцев. Воложин А.И., Ильин В.К.,Максимовский Ю.М.,Сидоренко А.Б.,Истранов Л.П., Царев В.Н., Истранова Е.В., Абоянц Р.К. Разработка и применение пародонтальной повязки из коллагена и суспензии клеток 37 в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта//Стоматология двухмесячный научнопрактический журнал. - 2004. - Т. 83.6 . -с. 6-8. Задача изобретения терапевтическая эффективность при лечении и профилактике пародонтита. Технический результат, может быть, достигнут при использовании молочнокислых бактерий, ,и 6 желатинового матрикса. Консорциум бактерий создан методом совместного культивирования четырех штаммов лактобацилл, выделенных из клинически здоровых людей и молочных продуктов. В качестве носителя консорциума используется желатин. Пробиотический комплекс обладает антагонистической, антилизоцимной, адгезивной активностями, устойчивостью к антибиотикам. Достижения технического результата получен пробиотический комплекс в виде пародонтальных стрипов, в состав которых входит пробиотический консорциум микроорганизмов и желатин. Заболевания пародонта представляют собой серьезную медико-социальную проблему в связи широкой распространенностью во всем мире тяжестью течения, трудностями в лечении. За последнее десятилетие интерес и внимание специалистов к вопросам адекватного и эффективного лечения заболеваний пародонта значительно возрос. Многочисленными исследованиями подтверждена важная роль микробного фактора в этиологии пародонтита. Полость рта представляет собой своеобразную экологическую систему, которая тесно связана с 2 внутренней средой организма и его внешним окружением. Неотъемлемой частью микроэкосистемы полости рта является нормальная микрофлора,которая рассматривается как первичная мишень для любого фактора, прямо или опосредованно влияющего на адгезию и неспецифическую резистентность этой экосистемы. Из-за широкого, бесконтрольного применения антибиотиков нарушается нормальный микробиоценоз полости рта, что является одной из ведущих причин развития гнойно-воспалительных заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта. В связи с вышеизложенным, разработка препаратов восстанавливающих нормальный биоценоз полости рта имеет важное значение при лечении заболеваний пародонта. Этим требованиям отвечают препараты естественного происхождения и одними из них являются пробиотики, в состав которых входят микроорганизмы - естественные обитатели полости рта и кишечного тракта человека, а также сапрофиты окружающей среды. Полученный нами пробиотический комплекс предназначен для лечения и профилактики воспалительных заболеваний полости рта. Выделение чистой культуры В качестве исходного материала для исследований применялись молочнокислые продукты, пробы клинически здоровых людей. Молочнокислые продукты засевались в обогащенные среды МРС-1 и МРС-4 производства. . Биохимический и генетический анализ позволил определить видовую принадлежность выделенных штаммов. Определение антагонистической активности Антагонистическую активность штаммов лактобацилл по отношению к тест-культурам,,,,изучали методом отсроченного антагонизма. Для выявления биосовместимости культур лактобацилл в консорциуме был использован метод перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде (рисунок). По активному и равномерному росту,отсутствию зон задержки роста микроорганизмов в области их соприкосновения, внешнему виду штаммов, который соответствовал культурам, был сделан вывод, что штаммы находятся в состоянии симбиоза, что позволяет нам рекомендовать их для совместного использования в консорциуме. (Фиг. 1) Определение антилизоцимной активности Антилизоцимную активность определяли методом отсроченного антагонизма по О.В. Бухарину в модификации Соколова В.Ю. Для этого к 4 мл остуженного до 56 С 2 питательного агара добавляли 1 мл яичного белка, перемешивали и разливали в стерильные чашки Петри. На поверхность застывшего агара наносили петлей биомассу суточной агаровой культуры, формируя пятачки диаметром 3-5 мм. Культуры обрабатывали парами хлороформа в течение 30 мин и проветривали. К 3 мл 0,7 агара, остуженного до 48 С, добавляли 1 млрд. микробной взвеси, перемешивали и заливали вторым слоем. Посевы инкубировали при 37 С в течение 24 часов. Учет результатов в верхнем слое агара вокруг нанесенных бляшек антилизоцимоактивных штаммов исследуемых культур наблюдали зоны роста микрококка. В контроле (чашки без добавления лизоцима) наблюдали сплошной рост микрококка. Определение адгезивной активности. Адгезивную активность выделенных культур определяли с помощью реакции гемагглютинации по . Использовали смыв культур густотой 5 ЕД по оптическому стандарту ГИСК им. Л.А.Тарасевича и 0,5 взвесь эритроцитов человека. Технология совместного культивирования лактобацилл Для получения консорциумов использовали метод совместного культивирования активных штаммов лактобацилл. Из 24-часовых штаммов лактобацилл готовили культуральные взвеси по оптическому стандарту на 10 единиц и в равных соотношениях вносили в бульонную среду МРС-1. Для проверки качества полученных консорциумов учитывалось количество клеток микроорганизмов в 1 мл, изучались антилизоцимная, адгезивная,антагонистическая активности, устойчивость к антибиотикам. Сравнивали полученные параметры консорциумов с индивидуальными показателями составляющих компонентов. И отбирался консорциум с наиболее высокими показателями активности для приготовления биокомпозита. Разработка способа получения пробиотического комплекса на основе лактобацилл и желатинового матрикса Приготовленный 6 пищевой желатин смешивается с пробиотическим консорциумом таким образом, чтобы получить концентрацию 9 лактобактерий в комплексе 310 КОЕ/мл. Для получения концентрированной биомассы лактобактерий 48-часовые бульонные культуры с 9 концентрацией 10 кл/мл центрифугировали 5 минут при 5000 об/мин. Затем отмывали клетки в физиологическом растворе и смешивали с желатином, полученный комплекс подвергали высушиванию на установке фирмыпод вакуумом при температуре -180 С в течение 12 часов по достижении остаточной влажности образцов не более 3. В итоге, изобретение представляет собой пробиотический комплекс в виде высушенных пародонтальных пластин белого цвета, без специфического запаха с нейтральным вкусом,состоящих из,,,и 6 желатинового матрикса. Пробиотический комплекс имеет вид мембраны, толщиной 2-3 мм,имеет волокнистую пористую структуру белого цвета без специфического запаха с нейтральным вкусом. Концентрация лактобактерий в комплексе 9 составляет 3 х 10 КОЕ/мл., зоны угнетения роста тест-организмов, мм .23,00,9, .21,00, .22,00.6, .19,00,.28,00,6, .27,00,3,26,00,9. Обладает устойчивостью к канамицину и ванкомицину и умеренной устойчивостью к фуразолидону и цефазолину. Устойчив к действию лизоцима. Данный пробиотический комплекс позволяет восстановить нормальную микрофлору ротовой полости при пародонтите. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Были проведены доклинические испытания Пробиотического комплекса для лечения и профилактики пародонтита. Для этого были разработаны две модели острой и хронической форм пародонтита. Предварительно было получено заключение этической комиссии РГП Национальный Центр Биотехнологии КН МОН РК, разрешающее проведение доклинических испытаний на животных (лабораторные кролики и крысы). В результате проведенных исследований на модели хронического пародонтита у крыс,полученной в результате трехмесячной диеты с низким содержанием белка, сделано следующее заключение применение Пробиотического комплекса для лечения и профилактики пародонтита в течении 14 суток приводит местно к улучшению кровоснабжения десны, очищению пародонтальных карманов, что сопровождается улучшением самочувствия животных и характера стула. Анализ показателей периферической крови уже на 5-е сутки показал увеличение количества лейкоцитов, нейтрофилов, которые нормализуются к концу эксперимента. Эозинофилез наблюдавшийся к началу эксперимента в ходе лечения уменьшился до значений интактной группы. Пробиотический комплекс животные получали при сохранении малобелковой диеты, что указывает на эффективность местного лечения,несмотря на присутствие этиологического фактора. При использовании пробиотического комплекса на фоне экспериментального пародонтита,при морфологических исследованиях,отмечено снижение признаков воспалительного процесса с улучшением микроциркуляции,снижение диапедезных кровоизлияний мягких тканей уже в начальные сроки наблюдений. Применение Пробиотического комплекса при остром пародонтите у кроликов, полученного вследствие химического ожога, также показало их терапевтическую эффективность. В случае применения стрипов, несмотря на тяжесть гнойновоспалительных изменений в пародонтальной области (наличие глубоких эрозий и язв с гнойнонекротическим содержимым,пародонтальных карманов с гнойным содержимым, гиперемии и отечности слизистой и окружающей тканей) явления пародонтита были нивелированы к 14 3 суткам, хотя уже на 8-е сутки в случае с менее выраженными симптомами отмечалось выздоровление. Проведенные микробиологические исследования на моделях острого и хронического пародонтита показали, что входящие в состав препарата пробиотические штаммы лактобацилл обладают высокой антагонистической активностью к условнопатогенным представителям микрофлоры ротовой полости крыс и кроликов. На фоне применения Пробиотического комплекса в качестве терапевтического средства происходит значительное угнетение роста нежелательной микрофлоры ротовой полости животных (таких как.,.,., .,. и др.), вследствие чего процесс репарации тканей пародонта и излечения животного ускоряется. Применение желатинового матрикса, как видно из результатов исследований способствует усилению лечебных свойств пробиотического консорциума, так как известно, что желатин обладает кровоостанавливающими свойствами,содержит микро- и макроэлементы, являющиеся структурными компонентами соединительной ткани. Его применение также способствовало лучшей фиксации консорциума на десне. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Пробиотический комплекс для лечения и профилактики пародонтита,включающий молочнокислые бактерии, отличающийся тем, что содержит молочнокислые бактерии Фиг. 2 Общий вид крысы с моделью хронического пародонтита (а), и вид десны, прилегающей к нижним резцам (б), где наблюдается оголение шейки зуба за счет углубления десневых карманов. а б