Способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей

(51) 61 39/02 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ диагностике эпизоотического лимфангоита лошадей. Способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей, включающий выращивание культуры криптококков на питательной среде, приготовление суспензии,центрифугирование и получение надосадочной жидкости, в качестве штамма гриба используют штамм-0269 КазНИВИП 08, который выращивают на глицериноглюкозоманнитном мясопептонном бульоне, затем разрушают клетки культуры путем двухкратного воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 50 трихлоруксусную кислоту в соотношении 120, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С,полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворедо 8,5, доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 идо 7,2-7,5.(72) Кадыров Серикбай Оразбаевич Шалабаев Болат Абуович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Таранюк П.С. Опыты по изготовлению антигенов для РСК, их применению для диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей// Сборник научных работ Сиб.НИВИ,вып.4, Омск,1952, с.111-120(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭПИЗООТИЧЕСКОГО ЛИМФАНГОИТА ЛОШАДЕЙ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при Изобретение относится к области ветеринарной микологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей. Известен способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей, включающий выращивание культуры криптококков на питательной среде,приготовление суспензии, центрифугирование и получение надосадочной жидкости (Таранюк П.С. Опыты по изготовлению антигенов для РСК, их применению для диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей // Сборник научных работ Сиб. НИВИ, вып. 4. Омск, 1952, с.111-120). Недостатком данного способа является то, что полученный антиген не позволяет выявлять латентные формы инфекции. Задачей изобретения является получение высокоактивного и стабильного антигена,позволяющего выявлять латентные формы криптококковой инфекции и обладающего достаточной активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при диагностике эпизоотического лимфангоита лошадей. Способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей, включающий выращивание культуры криптококков на питательной среде, приготовление суспензии,центрифугирование и получение надосадочной жидкости, в качестве штамма гриба используют штамм-0269 КазНИВИП 08, который выращивают на глицериноглюкозоманнитном мясопептонном бульоне, затем разрушают клетки культуры путем двухкратного воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 50 трихлоруксусную кислоту в соотношении 120, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С,полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворедо 8,5, доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5. В изобретении используется штамм гриба-0269 КазНИВИП 08,депонированный в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт. Штамм характеризуется следующими признками, которыми обладает гриб. Морфологические признаки. Вакцинный штамм-0269 КазНИВИП 08 обладает морфологическими признаками,2 характерными для возбудителя лимфангоита лошадей. Окрашенные по Грамму культуры гриба грамположительные. Культуральные свойства. Молодые 7-дневные колонии совершенно гладкие, ровные. Колония на средах значительно улучшает рост мицелия добавление к среде глюкозы, маннита, глицерина и особенно, дополнительная прибавка пептона, к 10-му дню достигает диаметра 12-16 мм, на среде Чапека - 10-12 мм. После 10-14 дней становятся складчатыми, иногда с трещинами, бархатистопушистыми, зелено-коричневыми. Бахромчатые,погруженные в субстрат края колонии коричневого цвета. Обратная сторона колоний темнокоричневого в зрелых и старых культурах темного цвета. Мицелий септированный, ветвящийся,шириной до 3-5 мкм, редко завитки (спирали и кольцевидные) окончания гиф и интеркалярными хламидоспорами диаметром 3-5-1034 мкм. Многочисленные хломидоспоры встречаются по разной форме,округлые,грушевидной,толстостенной и с зернистой на коротких ножках расположены по бокам мицелия. Средние размеры их 3-5 мкм. Артроспоры встречаются в старых культурах. Биохимические свойства. Штамм гриба-0269 КазНИВИП 08 хорошо растет на МПА, значительно улучшает рост мицелия, добавление к среде глюкозы, маннита,глицерина и особенно, дополнительная прибавка пептона, избирательно поражаемом данным грибом. Культивирует при температуре 25-27 С в течение 810 дней. В этих условиях наблюдается ускорение лагфазы и усиливается накопление биомассы (у эталонного штамма за 15 сут). Бахромчатые,погруженные в субстрат края колонии коричневого цвета. Обратная сторона колоний темнокоричневого в зрелых и старых культурах темного цвета. Из числа углеводов плохо усваивается сахароза. Факторами роста является глюкоза,глицерин, пептон и маннит. Элементами питания является азот, углерод, водород, кислород, а наиболее важные микроэлементы - фосфор и сера. Все эти микро- и макроэлементы участвуют во всех биохимических реакциях происходящих в клетках. Сероводород и индол не образуют. Антигенные свойства. На введения культуры штамма в организме лошадей, кроликов и морских свинок образуются специфические агглютинины в титрах 140- 11280. Маркерные признаки. Биохимические - на МПА при рН 7,4-7,6 до концентрации белка 6-8 мг/см 3 . Многочисленные хломидоспоры, округлые,грушевидной, толстостенной и с зернистой на тонких коротких ножках расположены по бокам мицелия. Средние размеры их 3-72-3 мкм. Артроспоры встречаются в старых культурах по форме они слегка булавовидные, удлиненно овальные с тупым наружным концом, размером 4-8 мкм в диаметре. Физиологические хемогетеротроф. По отношению к кислороду аэроб. Не обладает метаболическими свойствами. В минеральном питании для основного обмена грибов, необходимы азот, углерод, кислород, водород, фосфор, калий,магний, железо, медь, цинк, марганец, молибден,кальций, кобальт, ванадий. Иммунохимические - в реакциях РСК и РДСК титры антител составляют от 110 до 11280 отличается от эпизоотических штаммов слабой вирулентностью, высокой спорогенностью и активностью при внутримышечном введении. Патогенные свойства. Штамм гриба-0269 КазНИВИП 08 патогенный для лошадей, ослов и мулов. Иммуногенность. При двукратном внутримышечном введении штамма в дозе 5,0 см 3 создают напряженный иммунитет у привитых лошадей, продолжительностью не менее 12 месяцев. Реактогенность. Штамм гриба-0269 КазНИВИП 08 слабореактогенен для лошадей при внутримышечном введении. Спророобразование. Максимальный уровень спорообразования на МПА 300-350 млн/см 3 . Реверсабельность и реактогенность. Штамм гриба отличается от эпизоотических изолятов слабой вирулентностью, отсутствием заражения при контакте между животными, высокой активностью при внутримышечном введении. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма гриба-0269 КазНИВИП 08 стабильно сохраняются на протяжении 5 лет при условии редких пересевов (2-3 раза в год), не ослабляя патогенные свойства. Штамм гриба-0269 КазНИВИП 08 не снижает активности при температуре 2-10 С в течение 12 месяцев в нативном состоянии в течение 6 месяцев, в замороженном при минус 40 С в течение 6 месяцев,при 20 С в течение 2 лет. Способ получения антигена состоит в следующем. Пример 1. Способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей, включающий выращивание культуры грибов на питательной среде с последующим снятием биологической массы,смывание,отмывание,суспендирование,ресуспендирование в физиологическом растворе,фильтрацию взвеси, инактивацию, добавление 0,5 формалина и выдерживание при температуре 37 С в течение 2 дней, в качестве грибковой культуры используют штамм гриба-0269 КазНИВИП 08, который выращивают на твердой питательной среде с последующим смывом биологической массы,отмыванием и суспендированием в физиологическом растворе,полученную суспензию,инактивируют ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-А двукратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, затем добавляют 50 трихлоруксусную кислоту, разведенную в 19 частях гомогената и полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют на 10 ч при температуре 3 5 С, после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость удаляют,осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость вновь отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворе с 8,5, тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч,затем встряхивают,фильтруют через четырехслойную марлю и доводятдо 7,0-7,2,после чего антиген растворяет в физиологическом растворе до концентрации белка 1 мг/см 3 . Пример 2. Культуру штамма гриба-0269 КазНИВИП 08 выращивают на твердой питательной среде в течение 21 суток с последующим их снятием с поверхности агара и добавляют физиологический раствор 7,0-7,2,измельчают в гомогенизаторе, фильтруют через четырехслойный марлевый фильтр,затем инактивируют ультразвуком двукратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин и добавляют 50 трихлоруксусную кислоту,разведенную в 19 частях гомогената, полученную смесь тщательно перемешивают, и оставляют на 10 ч при температуре 5 С, затем, после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость удаляют,осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость вновь отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворе с 8,5, тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч,затем встряхивают,фильтруют через четырехслойную марлю и доводятдо 7,0-7,2,после чего антиген растворяют в физиологическом растворе до концентрации белка 1 мг/см 3 . Пример 3 . Штамм гриба-0269 КазНИВИП 08 выращивают на мясопептонном бульоне с содержанием 2 глицерина, 2,5 глюкозы и 1 маннита, при этом в 1 л мясопептонного бульона содержится 20 г глицерина, 25 г глюкозы и 10 г маннита. Полученную культуральную массу гомогенизируют в гомогенизаторе-309 в течение 5 мин, доводят рН 8,5, смесь тщательно перемешивают и подвергают разрушению ультразвуком 22 кГц и мощности 100 Вт/ см 2 по 30 мин двукратно. После чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, собирают надосадочную жидкость в стерильную колбу, добавляют 50 раствор трихлоруксусной кислоты в объемном соотношении 120, тщательно перемешивают, оставляют на холоде 10 ч при температуре 5 С, периодически перемешивая. Смесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают,а осадок растворяют в физиологическом растворе с 8,5 и доводят до концентрации белка 1 мг/см 3 . Полученный прозрачный опалесцирующий раствор, представляющий собой фракцию белка, 24522 используют в качестве лимфангоитного антигена для РДСК. Активность полученного описанным способом антигена была проверена в лабораторных условиях при постановке РДСК с сыворотками крови от здоровых и больных лошадей. Результаты оценки активности предлагаемого антигена для РДСК при эпизоотическом лимфангоите лошадей приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген, полученный с серопозитивными описанным способом,сыворотками в разведениях 15 и 110 дает положительные результаты при разведении антигена 1200,с серонегативными дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его качестве антигена для РДСК,обладающего высокой чувствительностью в выявлении эпизоотического лимфангоита лошадей. Готовый антиген расфасовывают в стерильные ампулы по 1 мл подвергают сублимационной сушке. Антиген может храниться до 6 мес. при температуре 4 С и в лиофилизированном виде 2-3 года, не теряя своего исходного титра. Перед использованием его необходимо титровать с положительными и отрицательными сыворотками. Предложенный способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей обеспечивает высокую активность и специфичность антигена, что позволяет повысить достоверность серологических реакций. Таблица 1 Оценка активности предлагаемого антигена для РДСК при эпизоотическом лимфангоите лошадей Наименование Положительной Отрицательной Контроль (физ.раствор) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангиота лошадей, включающий выращивание культуры криптококков на питательной среде, приготовление суспензии,центрифугирование и получение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма гриба используют штамм-0269 КазНИВИП 08,который выращивают на глицериноглюкозоманнитном мясопептонном бульоне, затем разрушают клетки культуры путем двухкратного воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин,после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 50 трихлоруксусную кислоту в соотношении 120, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С,полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворедо 8,5, доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 идо 7,2-7,5.