Способ получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки

(51) 61 39/02 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ оптимального способа получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки путем применения иммунокорректора тималина. Способ получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки включающий иммунизацию животных-доноров антигеном, получение от них крови и отделение сыворотки,в качестве животных-доноров используют кроликов, а их иммунизацию осуществляют цельноклеточным антигеном из штаммаВ-0115 КазНИВИ,при этом проводят четырехкратную иммунизацию кроликов введением антигена в концентрации 10 млрд. м.т. внутривенно с интервалами 5 дней в увеличивающихся дозах от 0,5 см 3 до 2,0 см 3 ,одновременно внутримышечно вводят по 5,0 мг тималина, затем на 8 день после последней иммунизации кроликов тотально обескравливают,отделяют сыворотку и получают целевой продукт в титре 11600 - 13200.(72) Сембина Фатима Егимбаевна Шманов Кайырбай Сагнтаевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Бутова Т.А. Антигенные свойства, выделенного от животного и птицы. Москва, 1988, с.25(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗНОЙ АГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для серологических исследований при кампилобактериозе. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для серологических исследований при кампилобактериозе. Известен способ получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки,включающий иммунизацию животных-доноров антигеном,получение от них крови и отделение сыворотки Бутова Т.А. Антигенные свойства, выделенного от животных и птицы.Автореф.дисс.канд.биол.наук, Москва, 1988, с.25. Недостатком этого способа является повышенная дозировка вводимого антигенного материала и невысокая активность полученных сывороток. Задачей изобретения является получение кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки с меньшей дозировкой вводимых антигенов и повышенным выходом целевого продукта. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании оптимального способа получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки путем применения иммунокорректора тималина. кампилобактериозной Способ получения агглютинирующей моноспецифической сыворотки включающий иммунизацию животных-доноров антигеном, получение от них крови и отделение сыворотки,в качестве животных-доноров используют кроликов, а их иммунизацию осуществляют цельноклеточным антигеном из штаммаВ-0115 КазНИВИ,при этом проводят четырехкратную иммунизацию кроликов введением антигена в концентрации 10 млрд м.т. внутривенно с интервалами 5 дней в увеличивающихся дозах от 0,5 см 3 до 2,0 см 3,одновременно внутримышечно вводят по 5,0 мг тималина, затем на 8 день после последней иммунизации кроликов тотально обескравливают,отделяют сыворотку и получают целевой продукт в титре 11600 - 13200. В изобретении используется штамм бактерийВ-0115 КазНИВИ,депонированнный в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт. Идентификацию штамма бактерий проводят по морфологическим, культуральным и физиолого биохимическим свойствам согласно определителю-,-,-/, 2005. -.. - 1147 - 1160 . Штамм характеризуется следующими признакам,которыми обладает культура Морфологические признаки.В - 0115 КазНИВИ - изогнутая палочка в виде летящей чайки, 1 - 1 0 мкм в длину и 0,2 - 0,8 мкм в ширину. Кампилобактерии подвижные, с монотрихиально расположенными жгутиками, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Кампилобактерии являются микроаэрофилами. Растут на полужидком условиях,агаре при микроаэрофильных оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,0-7,2. На ПЖА растут в виде диска под поверхностью агара, на МППА - прозрачные сероватого цвета круглые, выпуклые колонии. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют в шероховатые- формы. Учет характера роста необходимо проводить через 36 - 48 часов. Установив по культуральным и морфологическим признакам родовую принадлежность проводят дальнейшую типизацию для установления видовой и подвидовой типизации. Биохимические свойства. Отличительной особенностью кампилобактерии подвида фетус, в том числе и штаммаВ 0115 КазНИВИ, является то, что они выделяют каталазу, не образуют сероводород, растут на средах с добавлением 1 глицина, 8 глюкозы, 10 желчи, не растут на средах с добавлением 3,5 хлорида, не выделяют индол, аммиак, не разжижают желатин, не свертывают молоко, переводят нитраты в нитриты. Культуры не ферментируют углеводы(глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, маннит), не растут на ПЖА при 25 С. Антигенная структура. УВ - 0115 КазНИВИ два основных антигенных комплекса О антиген(соматический) термостабильный, Н - антиген (жгутиковый) белковой природы, термолабилен. У всех серотипов имеется общий жгутиковый белковый антиген (Нантиген), тогда как соматические антигены специфичны для каждого подвида и подтверждают принадлежность культур к тому или иному серотипу. ШтаммВ - 0115 КазНИВИ является эпизоотическим, обладает абортогенными свойствами для суягных овцематок и высокой вирулентностью для белых мышей за время хранения и пересевах в лабораторных условияхВ - 0115 КазНИВИ не изменил культурально морфологических, биохимических свойств, а также патогенность,вирулентность и антигенную структуру. Маркерные признаки штаммаВ - 0115 КазНИВИ, физиологические хемогетеротроф, является микроаэрофилом. Растет на средах с добавлением глицина. Возможна диссоциация из - в - форму,приобретение лекарственной устойчивости. Серологические при типизации с диагностическими моноспецифическими агглютинирующими кампилобактериозными сыворотками , ,типов имеет положительную реакцию с сывороткойтипа и отрицательную реакцию с сывороткамиитипов. Патогенные свойства. ШтаммВ - 0115 КазНИВИ обладает патогенными свойствами для белых мышей массой 1 6 - 1 8 граммов, при подкожном введении 0,4 см 3 суточной бульонной культуры, вызывая гибель всех 10 мышей.В - 0115 КазНИВИ обладает абортогенными свойствами для суягных овцематок. При подкожном введении 1 -5 млрд. м.т./ см 3 штаммВ-0115 КазНИВИ вызывает аборты у овец. Вирулентность для белых мышей. ШтаммВ-0115 КазНИВИ обладает выраженной вирулентностью для белых мышей массой 1 6 - 1 8 граммов, вызывая гибель 100 животных при подкожном введении 250 тыс. м. к. в 1 см 3 в дозе 0,4 см 3 на 2 - 3 сутки. Иммунохимические - реакция агглютинации(РА) в титре - 13200. Дополнительные сведения. ШтаммВ-0115 КазНИВИ свободен от бактериальных, грибковых, микоплазменных и вирусных контаминантов. Способ получения моноспецифических кампилобактериозных сывороток заключается в следующем. Пример 1. Антиген получают путем культивирования штаммов кампилобактерии в пробирках на ПЖА с добавлением 10 ферментативного гидролизина. Культуры выращивают в термостате при 37 С в эксикаторах при микроаэрофильных условиях в течение 48 часов. Культуры двухсуточного роста проверяют по результатам микроскопического исследования и отбирают наиболее типичные по морфологическим признакам колонии. Последующее накопление бакмассы производят во флаконах с ПЖА, после двухсуточного культивирования проверяют на чистоту роста микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и рассевают в колбы Тартаковского с 2,5 - 3,0 мясо-пептонным печеночным агаром (МППА). После 2-3 суточного культивирования чистый рост культуры смывают формалинизированным(0,3) стерильным физиологическим раствором. Смыв культуры дважды промывают на центрифуге при 3000 оборотах в минуту, суспендируют до концентрации 10 миллиардов микробных тел в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности и используют в качестве антигена для иммунизации кроликов. Пример 2. Для иммунизации кроликов используют формалинизированные цельноклеточные ОН - антигены. Приготовленные антигены проверяют на стерильность путем высева на питательные среды (МПБ, МППА). На каждый испытуемый штамм берут по 3 кролика массой 2,53,0 кг серонегативных на кампилобактериоз. Антигены в концентрации 10 млрд.м.т. в 1 мл вводят кроликам внутривенно и подкожно четырехкратно с интервалом 5 дней в нарастающих Параллельно дозах 0,51,0 1,52,0 см 3. иммунизируют кроликов с применением дополнительно иммунокорректора тималина. При этом антиген вводят внутривенно четырехкратно с интервалом 5 дней в нарастающих дозах 0,5 1,0 1,52,0 см 3, а иммунокорректор - внутримышечно соответственно по 5 мг в 1,0 см 3 . Кровь от кроликов берут через 8 дней после окончания иммунизации. Схема иммунизации кроликов с применением иммунокорректора и без него отражена в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что при использовании иммунокорректора удалось значительно снизить антигенную нагрузку при иммунизации. Пример 3. Полученную моноспецифическую сыворотку проверяют на специфическую активность в реакции агглютинации (РА) с гомологичным антигеномтипа и гетерологичными антигенамии типов. Готовят последовательно удваивающиеся разведения полученной сыворотки от 150 до 16400 в 3-ном растворе хлористого натрия, содержащего 0,3 формалина. Затем в каждую пробирку с добавляют по 0,5 см 3 гомологичного антигена и помещают в термостат при температуре 37 С на 16-18 часов, через 3-4 часа после изъятия реакции из термостата учитывают ее результаты. Контролями реакции служат полученная сыворотка с гетерологичными антигенамиитипов. При этом, результаты реакции признают специфическими, если в контрольных пробирках агглютинация отсутствует. Степень агглютинации определяют по четырехбальной системе в крестах. Предельным титром считают разведение сыворотки, где была отмечена агглютинация не ниже, чем на два креста. Результаты реакции приведены в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что применение тималина позволило повысить титры антител специфических сывороток за счет увеличения антителообразования у животных-продуцентов. Использование способа получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки позволит типизировать штаммы кампилобактерии и контролировать антигены при исследовании сывороток крови абортировавших животных. Таблица 2 Результаты сравнительного изучения специфической активности моноспецифических кампилобактериозных сывороток Кампилобактериозные сыворотки Схемы иммунизации Без иммуногена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения кампилобактериозной агглютинирующей моноспецифической сыворотки,включающий иммунизацию животных-доноров антигеном, получение от них крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют кроликов, а их иммунизацию осуществляют цельноклеточным антигеном из штаммаВ 0115 КазНИВИ, при этом проводят четырехкратную иммунизацию кроликов введением антигена в концентрации 10 млрд. м.т. внутривенно с интервалами 5 дней в увеличивающихся дозах от 0,5 см 3 до 2,0 см 3, одновременно внутримышечно вводят по 5,0 мг тималина, затем на 8 день после последней иммунизации кроликов тотально обескравливают, отделяют сыворотку и получают целевой продукт в титре 11600 - 13200.