Способ получения единого антигена при диагностике бруцеллеза в РА и РСК

(51) 61 39/10 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ производства единого антигена, используемого при диагностике бруцеллеза в РА и РСК. Способ получения единого антигена при диагностике бруцеллеза в РА и РСК, включающий выращивание трех вакцинных штамма бруцелл 19,-1 и 61 на эритрит-агаре, с добавлением 0,2 цистина и 0,2 дрожжевого экстракта, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием,стабилизацию при 2-4 С в течение 10 дней и определение активности. Способ позволяет повысить выход,чувствительность и активность целевого продукта.(72) Хусаинов Дамир Микдатович Иванов Николай Петрович Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Есполов Тлектес Исабаевич Кожаев Аскар Нурсултанович(56) Касьянов А.Н. и др. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК, РДСК // Ветеринария, 1973, 10, с.50-52(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕДИНОГО АНТИГЕНА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА В РА И РСК 22740 Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии,а именно к технологии производства единого антигена, используемого при диагностике бруцеллеза в РА и РСК. Известен способ получения единого антигена при диагностике бруцеллеза в РА и РСК,включающий выращивание бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием, стабилизацию при 2-4 С в течение 10 дней и определение активности, при этом в качестве бруцелл используют штамм(А.Н.Касьянов и др. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК, РДСК // Ветеринария.-1973.- 10.-с. 50-52). Недостатком этого способа является то, что этим способом получают антигены, реагирующие в основном только с агглютининами, гомологичными антителами, и непригодные для выявления хронических и латентных форм инфекции. Задача изобретения - повышение выхода,чувствительность и активность целевого продукта. Задача решается тем, что в качестве бруцелл используют три штамма бруцелл 19,-1 и 61. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода,чувствительность и активность целевого продукта. Сущность способа получения единого антигена для серологической диагностики бруцеллеза включает рассев бруцеллезных культур штаммов 19,-1 и 61 на плотных питательных средах(эритрит-агар) с добавлением 0,2 цистина и 0,2 дрожжевого экстракта, их выращивание, смыв выращенных культур стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2), инактивацию полученных суспензий при температуре 80 С в течение 60 мин, с последующим смешиванием инактивированных суспензий бруцелл 19,-1 и 61 в соотношении 11, с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК. Пример приготовления единого антигена состояла в следующем. Бруцеллы вакцинных штаммов 19,-1 и 61 раздельно высевают на твердые питательные среды(эритрит-агар), с добавлением 0,2 цистина и 0,2 дрожжевого экстракта, помещенную в посевную емкость. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные мкости помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуру смывают стерильным 0,5 -ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2. Смытую 2 культуру сливают и инактивируют при 80 С в течение 60 минут. Прогретую суспензию проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому и высева на МПБ, МПА, печеночномартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. Далее осуществляют смешивание инактивированных суспензий бруцелл штамма 19,-1 и 61 в соотношении 11 с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК. Активность антигена в РА стандартизируют по национальной стандартной агглютинирующей сыворотке антиабортус, содержащей в 1 см 3 1000 международных единицантител. Содержимое ампулы (сухую стандартную сыворотку) растворяют дистиллированной водой, а затем разводят 0,5 ным фенолизированным физиологическим раствором 1150, 1200, 12540, 1300 и 1350. Полученные разведения сыворотки хранят в стерильных флаконах. Концентрат антигена разводят 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором 13 13,5 14 и т.д. до 116. Каждое разведение антигена испытывают со всеми пятью разведениями каждой сыворотки при одинаковой дозировке ингредиентов, равной 0,5 см 3. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведении 125, 150 и 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором. Пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 23 ч и затем при комнатной температуре 1 ч. Активность антигена в РСК определяют титрованием по квадратной схеме со стандартной позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях 150, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведениях 15 и 110. Антиген(стандартизированную в РА взвесь бруцелл) разводят 150, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400. Комплемент и гемолизин берут в рабочих титрах,эритроциты -2,5 от осадка. Сыворотку инактивируют 30 минут при температуре 58-60 С. Предельным титром антигена считают то его разведение, которое дает полную задержку гемолиза с наибольшим разведением бруцеллезной сыворотки. За рабочий титр антигена в РСК принимают двойную дозу его предельного титра. Антиген выпускают, если в РА его разведение 15 с конечным разведением стандартной бруцеллезной сыворотки 1500 дает 50 агглютинациив РСК - дает полную задержку гемолиза со стандартной бруцеллезной сывороткой в ее предельном титре при разведении антигена не ниже чем 1100. При проведении производственного испытания единого бруцеллезного антигена полученного из 22740 трх штаммов бруцелл разной видовой принадлежности,использовали единый бруцеллезный антиген,изготовленный по существующей методике. Сыворотку исследовали в серологических реакциях агглютинации (РА) и связывания комплемента (РСК). Исследования проводили на животных неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, а также в благополучных хозяйствах. Всего было подвергнуто исследованию 126 сывороток крови от крупного рогатого скота, 26 - от свиней, 428 - от мелкого рогатого скота. Полученные при этом данные приведены в таблице 1. Таблица 1 Результаты испытания активности и специфичности предлагаемого бруцеллезного антигена в сравнении с существующим антигеном Вид животных Благополучие хозяйства по бруцеллезу Крупный рогатый скот Свиньи Мелкий рогатый скот Крупный рогатый скот Свиньи Мелкий рогатый скот Количество исследованных проб сывороток 116 Результаты исследования в РА СущесПредтвующая лагаемая 12 14 Результаты исследования в РСК СущесПредтвующая лагаемая 9 15 Как видно из данных таблицы 1, в результате проведенных испытаний установлена высокая активность и специфичность антигена, содержащего три штамма бруцелл. При этом значительное повышение чувствительности антигена наблюдали при диагностике бруцеллеза у овец и свиней,пораженных бруцеллами видаи(повышение выявляемости в среднем на 20-30 ). Определенное количество животных разных видов, реагирующих только на предлагаемый нами антиген, были убиты с целью последующего бактериологического исследования органов и лимфоузлов. Данные представленные в результате этих исследований приведены в таблице 2. Таблица 2 Результаты бактериологического исследования животных, реагирующих в РА и РСКп/п 1 2 3 4 Реагировало на антиген Выделено культур Диагноз рогатый опытная 2 бруцеллез рогатый опытная и контрольная 5 Из данных, приведенных в таблице 2 видно, что опытный антиген оказался более чувствительным и имел достаточно высокую специфичность. Так, из трех убитых коров, реагирующих только на опытный антиген, в 2-х случаях выделена культура бруцелл, что составляет 50,0. Тогда как от 6 животных, реагирующих на оба антигена, культура бруцелл выделена в 5 случаях или 83,3 . При исследовании 6 животных мелкого рогатого скота бруцеллы выделены в 5 случаях, или 83,3, а 3 22740 от животных, реагирующих на оба антигена,культуры бруцелл выделены в 77,7 случаях. Таким образом, полученный единый антиген способен вступать в реакцию с антителами к разным видам бруцелл, что приводит к повышению его чувствительности и активности. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения единого антигена при диагностике бруцеллеза в РА и РСК, включающий выращивание бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором, инактивацию полученной суспензии нагреванием, стабилизацию при 2-4 С в течение 10 дней и определение активности, отличающийся тем, что в качестве бруцелл используют три вакцинных штамма 19,-1 и 61, которые раздельно высевают на эритрит-агар, с добавлением 0,2 цистина и 0,2 дрожжевого экстракта.