Способ получения единого цветного антигена для серологических реакций при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных

(51) 61 39/10 (2010.01) 01 33/531 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного единого бруцеллезного цветного антигена для постановки серологических реакции при диагностике бруцеллеза животных. Способ получения единого цветного антигена для серологических реакций при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культурыиз штамма 19, содержащий в своем составе -формы бруцелл, инактивацию при температуре 80 С в течение 1 ч, центрифугирование полученной суспензии при 6000 об/мин в течение 30 мин,отделение надосадочной жидкости,окрашивание осадка 0,2 спиртовым раствором анилина голубого, повторного центрифугирования осадка при 6000 об/мин в течение 20 мин,повторение окрашивания,ресуспендирование окрашенного осадка в 0,5 фенолинизированном физиологическом растворе и доводение рН суспензии до 4,5 добавлением молочной кислоты,окрашивание осадка проводят однократно 0,2 спиртовым раствором анилина голубого,шуттилируют в течение 4-6 ч, промывают дистиллированной водой трижды, и доводят рН до 3,65 с помощью молочной кислоты. 4 табл.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Мустафин Батыржан Муафикович Тен Виктор Борисович Султанов Ахметжан Акиевич Мырзалиев Ахан Жахангерович Акымбек Динара Илаловна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт Акционерное общество Национальный инновационный фонд(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕДИНОГО ЦВЕТНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической 19672 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ получения единого цветного антигена для серологических реакций при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий выращивание культурыиз штамма 19, содержащий в своем составе -формы бруцелл, инактивацию при температуре 80 С в течение 1 ч, центрифугирование полученной суспензии при 6000 об/мин в течение 30 мин,отделение надосадочной жидкости,окрашивание осадка 0,2 спиртовым раствором анилина голубого, повторного центрифугирования осадка при 6000 об/мин в течение 20 мин,повторение окрашивания,ресуспендирование окрашенного осадка в 0,5 фенолинизированном физиологическом растворе и доводение рН суспензии до 4,5 добавлением молочной кислоты Предварительный патент Республики Казахстан 13979, кл. А 61 К 39/10, 2004. Недостатком данного способа является то, что процесс изготовления антигенов трудоемок,длителен и требует значительных затрат. Задачей изобретения является разработка эффективного способа приготовления единого бруцеллезного цветного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, пластинчатой реакции агглютинации (ПРА) и реакция агглютинации (РА),обеспечивающего эффективность целевого продукта, а также повышение результативности,чувствительности, специфичности и наглядности названных реакций и сокращение времени для получения серологических результатов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного единого бруцеллезного цветного антигена для постановки серологических реакции при диагностике бруцеллеза животных. Способ получения единого цветного антигена для серологических реакций при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культурыиз штамма 19, содержащий в своем составе -формы бруцелл, инактивацию при температуре 80 С в течение 1 ч, центрифугирование полученной суспензии при 6000 об/мин в течение 30 мин,отделение надосадочной жидкости,окрашивание осадка 0,2 спиртовым раствором анилина голубого, повторного центрифугирования осадка при 6000 об/мин в течение 20 мин,повторение окрашивания,ресуспендирование окрашенного осадка в 0,5 фенолинизированном физиологическом растворе и доводение рН суспензии до 4,5 добавлением молочной кислоты,окрашивание осадка проводят однократно 0,2 спиртовым раствором анилина голубого,шуттилируют в течение 4-6 ч, промывают дистиллированной водой трижды, и доводят рН до 3,65 с помощью молочной кислоты. 2 Способ получения единого бруцеллезного цветного антигена состоит в следующем. Пример 1. Культуруиз штамма 19 выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут с последующем их смывом 0,5 фенолинизированным раствором,полученную бактериальную суспензию фильтруют через двойной марлевый фильтр, определяют количество микробных клеток и прогревают в водяной бане при температуре 80 С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Затем полученную бактериальную суспензию проверяют на чистоту и стерильность путем высева на питательные среды. Полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осадок доводят физиологическим раствором до 100 млрд. микробных клеток в 1,0 см 3. После чего,стерильную взвесь клеток бруцелл окрашивают раствором анилина голубого, который готовят таким образом в конической колбе на 1000,0 см 3 растворяют 0,2 г сухого порошка анилина голубого в 100,0 см 3 этилового спирта 96 С, выдерживают при периодическом помешивании на водяной бане при температуре 90 С и после полного растворения красителя доводят до 1000,0 см 3 дистиллированной водой. Полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин для завершения процесса активации красителя. В конечной стадии окраска раствора должна быть ярко-синей. Окрашивание клеток бруцелл проводят в течение 4-6 ч, помешивая на шуттель- аппарате. Окрашенные клетки бруцелл центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Затем окрашенные клетки бруцелл промывают дистиллированной водой трехкратно, путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, при этом надосадок удаляют, а полученный осадок ресуспендируют в буфере с рН 3,65 до 4 концентрации, тщательно перемешивают и помещают в холодильник при температуре 4 С на 24 ч и используют в качестве диагностического препарата. Пример 2. Постановку ускоренный РА при исследовании сывороток крови сельскохозяйственных животных проводят в объеме 1,0 см 3 в четырех разведениях. При этом используется 2 раствор . Реакцию ставят в объеме 1,0 см в чистых стеклянных пробирках в четырех разведениях при исследовании сывороток крови пушных зверей и морских свинок - 110, 120,140, 180 свиней, овец, коз, в разведениях 125,150, 1100, 1200 крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов 150, 1100, 1200, 1400. Для исследования каждой испытуемой сыворотки требуется 5 пробирок. После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду, в пробирки третьего, четвертого и пятого ряда вливают по 0,5 см раствора хлорида натрия и титруют мерными пипетками или дозаторами Флоринского. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контроли - с негативной и бруцеллезной сыворотками. 19672 После этого в каждую пробирку второго,третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками, вносят по 0,5 см 3 цветного антигена,предварительно разбавленного в соотношении 110 раствором хлорида натрия. Тщательно перемешивают до получения однородной массы и помещают в термостат при температуре 37-38 С на 2 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин, после чего проводят учет реакции. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по принятой для РА методике. За диагностический титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в 2 креста,что соответствует количеству международных единиц антител в 1,0 см 3 сыворотки. Пример 3. ПРА с единым бруцеллезным цветным антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, верблюдов,пушных зверей и животных некоторых других видов. Реакцию проводят на чистых белых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30 С. Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,02-0,03 см 3 вносят на дно лунки микропипеткой, куда рядом вносят 0,02-0,03 см 3 антигена, которые тщательно в каждой лунке смешиваются ручным смесителем до получения однородной смеси, распределяя ее, при этом, по всей поверхности лунки. Пластинку со смешанными сыворотками и антигеном покачивают в течение 2-3 минут осторожным вращательными движениями, по истечении которого проводят визуальный учет результатов реакции в течение 2-3 минут по общепринятой для ПРА методике. При постановке реакции одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативными и позитивными сыворотками. Пример 4. КР с молоком проводят в чистых сухих стеклянных пробирках, на которых указывают номер испытуемой пробы молока. Для этого берут по 2 см 3 молока и добавляют по 0,1 см 3 антигена,затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли со смесью молока здоровый коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,1 см 3 сыворотки на 2 мл молока). Затем штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водную баню или термостат при температуре 37-38 С на 40 мин и, при необходимости,оставляют при комнатной температуре на 1 час, после чего проводят учет реакции. При положительной реакции на поверхности смеси появляется кольцо голубого(синего) цвета, а нижняя часть смеси остается белого цвета. При отрицательной реакции исследуемая смесь остается без изменений(голубого цвета) и специфическое кольцо не образуется. Пример 5. Специфичность и диагностическую ценность ускоренной РА с разработанным антигеном в сравнении с классической РА, РБП и РДСК с биофабричными антигенами определяли путем исследования сывороток крови 825 голов крупного и 210 голов мелкого рогатого скота, 90 лошадей и 42 верблюдов из различных по эпизоотическому состоянию по бруцеллезу ферм(хозяйств). Результаты этих исследований отражены в таблице 1. Из данных таблицы 1 видно, что при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота в РА с испытуемым цветным антигеном положительные результаты получены в 14, с биофабричным антигеном - в 10, РБП-13 и РДСК-14 пробах. Положительные результаты, при исследовании сывороток крови овец, в РА с испытуемым диагностикумом отмечены в -12, РА, РБП и РДСК с биофабричными антигенами в - 10, 9 и-5 случаях,соответственно. Сыворотки крови лошадей по всем тестам дали отрицательный результат. При исследовании сывороток крови верблюдов 1 проба дала положительный результат в ускоренной РА с разработанным цветным антигеном. В РБП,РДСК и в классической РА с биофабричными бруцеллезными антигенами получены отрицательные результаты. В результате проведенных исследований установлено, что разработанный единый цветной антиген для серологических реакций превосходит по чувствительности биофабричные антигены,применяемые в классической РА, РБП, РДСК при исследовании сывороток крови сельскохозяйственных животных. Кроме того,применение разработанного антигена в ускоренной РА при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез позволило получить результат уже через 3 часа., тогда как в классической РА только через 18 часов. Пример 6. Диагностическая ценность изготовленного антигена изучалась в КР путем исследования молока 110 коров, привезенных из различных хозяйств, в сравнении с КР с известным коммерческим антигеном. Результаты испытаний представлены в таблице 2. Таким образом, данные таблицы 2 наглядно показывают, что при исследовании молока коров в КР с известным коммерческим цветным антигеном было выявлено 11 положительных случаях (10,0),тогда как с помощью разработанного диагностикума в 15 случаях (13,6), что свидетельствует о превосходстве диагностической эффективности предлагаемого диагностикума. Таким образом, эти данные подтверждают высокую чувствительность разработанного цветного антигена при исследовании молока коров, что позволяет его использовать в КР для исследования молока коров на бруцеллез с целью предварительного распознавания эпизоотической ситуации по бруцеллезу в хозяйстве. Пример 7. Диагностическую ценность разработанного единого цветного антигена в пробирочной РА определяли также путем 3 19672 исследования сывороток молока в сравнении с биофабричным единым антигеном, а также цельного молока в КР, полученных от 422 коров из условно неблагополучных хозяйств. Результаты этих исследований отражены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, получены позитивные показания серологических тестов при исследовании цельного молока в КР с биофабричным антигеном в- 32 (7,5), с опытным антигеном в - 35 (8,2) случаях при исследовании сывороток молока в пробирочной РА с известным диагностикумом - в 29(6,8), с разработанным единым цветным антигеном - в 34 (8,0) случаях. Таким образом, результаты исследований показывают наибольшую диагностическую эффективность серологических тестов при использовании разработанного антигена как в пробирочной РА при исследовании сывороток молока, так и в КР с цельным молоком. Применение цветного антигена в РА и КР для исследовании молока животных на бруцеллез позволяет повысить результативность реакций и значительно сократить время получения диагноза на бруцеллез. Пример 8. Были проведены исследования сывороток крови 553 коров с целью изучения эффективности предлагаемого цветного антигена в ПРА путем параллельной постановки ПРА (РБП),РА РСК с использованием коммерческих препаратов. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 4. Приведенные в таблице 4 данные свидетельствуют, что в ПРА с испытуемым цветным и биофабричным антигенами положительно реагировало на бруцеллез по 12 животных, в РА - 10 и РДСК - 9. Таким образом,результаты испытания диагностической ценности предлагаемого диагностикума показывают возможность его одновременного применения во всех трех серологических тестах (ПРА, РА, КР), который обладает высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с известными биофабричными антигенами. Таблица 1 Результаты серологических исследований сывороток крови сельскохозяйственных животных на бруцеллез КРС МРС Лошади Верблюды УПРА с единым бруцеллезным цветным антигеном Пол. Отр. 14 811 12 198 90 1 41 Результаты реакции Классическая РА с РБП единым бруцеллезным антигеном Пол. Отр. Пол. Отр. 10 815 13 812 10 200 9 201 90 90 41 41 Таблица 2 Сравнительная диагностическая эффективность цветных антигенов для кольцевой реакции (КР) с молоком при бруцеллезе Испытуемые препараты Известный коммерческий цветной антиген для КР с молоком Разработанный цветной антиген для КР с молоком Количество проб молока, полученное от коров для исследований 110 Выявлено положительно реагирующих на бруцеллез коров 11 Таблица 3 Результаты серологических реакций с биофабричными и разработанными антигенами при исследовании молока коров на бруцеллез Вид животного Позитивные показания серологических реакций при исследовании молоко цельное сыворотки молока КР с КР с РА с РА с биофабразработанным биофабричным разработанным ричным антигеном единым антигеном антигеном антигеном 19672 Продолжение таблицы 3 32 35 29 34 7,5 8,2 6,8 8,0 Примечание. В числителе - абсолютное число, в знаменателе - процент положительно реагировавших животных. КРС Таблица 4 Результаты сравнительного изучения диагностической ценности разработанного цветного антигена в серологических тестах ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения единого цветного антигена для серологических реакций при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культурыиз штамма 19, содержащий в своем составе -формы бруцелл, инактивацию при температуре 80 С в течение 1 ч, центрифугирование полученной суспензии при 6000 об/мин в течение 30 мин, отделение надосадочной жидкости, отр. Количество положительно реагирующих животных РА с ПРА с РБП с РДСК биофабричным испытуемым биофабричным с биофабричным диагностицветным антигеном антигеном кумом антигеном отр. 545 12 545 9 544 окрашивание осадка 0,2 спиртовым раствором анилина голубого, повторного центрифугирования осадка при 6000 об/мин в течение 20 мин,повторение окрашивания,ресуспендирование окрашенного осадка в 0,5 фенолинизированном физиологическом растворе и доведение рН суспензии до 4,5 добавлением молочной кислоты,отличающийся тем, что окрашивание осадка проводят однократно 0,2 спиртовым раствором анилина голубого, шуттилируют в течение 4-6 ч,промывают дистиллированной водой трижды, и доводят рН до 3,65 с помощью молочной кислоты.