Способ диагностики вирусного гепатита С и определение генетического типа вируса

(51) 01 33/48 (2009.01) 01 33/53 (2009.01) 01 33/569(2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ кДНК, затем анализируют последовательность специфического участка кДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных(мостиковых) олигонуклеотидов, и при наличии специфического участка генома (-43-62) анализируемую ДНК относят к вирусному гепатиту С, а для определения генетического типа вируса выявляют вариабельные зоны в 5-нетранслируемой области генома вируса гепатита С и при наличии вариабельных зон (-150 170) определяют генотипы и субтипы 2 а и 2, при (115 -141) - генотипы и субтипы 3 а и 3, при наличии точечной мутации / (-98) - генотипы 1 а и 1. Предлагаемый способ диагностики ВГС и определения основных генотиповпозволит на практике решать ряд задач, таких как верификация диагноза, прогноз заболевания, назначение, оценка и прогноз эффективности комплексного, в том числе противовирусного лечения, дополнительная оценка активности вирусного процесса, а также изучение широты распространения ВГС в популяции и различных группах населения.(76) Шопаева Гульжан Амангельдыевна(К) Бейсембаева Шолпан Абаевна Пышная Инна АлексеевнаДмитриенко Елена Владимировна Зарытова Валентина ФилипповнаПышный Дмитрий Владимирович(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПА ВИРУСА(57) Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням и может быть использовано для диагностики вирусного гепатита С(ВГС) и определения генетического типа вируса. Способ диагностики вирусного гепатита С,включает исследование крови с определением РНК вируса гепатита С методом молекулярной гибридизации, при этом с помощью обратной транскриптазы синтезируют соответствующую 22681 Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням и может быть использовано для диагностики вирусного гепатита С (ВГС) и определения генетического типа вируса. Вирусные гепатиты являются глобально распространенной инфекцией. По разным оценкам инфицированность гепатитами В и С достигает от 1 до 2 млрд. человек, из них ежегодно от разных форм вирусного гепатита погибает около 2 млн. человек. В Казахстане по данным официальной статистики ежегодно 30 - 50 тыс. человек заболевают вирусными гепатитами, из них 65-75 инфицированных вирусом гепатита Симеют высокий риск развития хронической как печеночной, так и внепеченочной(системной) патологии. Отличительной особенностью ВГС является способность к длительной персистенции в организме что обусловливает высокий уровень хронизации инфекции. Считается, что манифестная форма ВГС наблюдается только у 25 больных. Низкий уровень виремии,свойственный-инфекции,способствует недостаточной стимуляции иммунного ответа и большинства инфицированных не приводит к элиминации вируса, и не защищает от реинфекции. Сложность диагностики-инфекции заключается в том, что у больных, инфицированных как вирусом гепатита В , так ичасто обнаруживается ДНКбез выявления . В большинстве случаев ВГС протекает бессимптомно,часто при этом отсутствуют какие-либо клинические и лабораторные изменения. Таким образом, отсутствие почти у половины больных ВГС факторов риска заражения в анамнезе,субклиническое течение, длительный латентный период являются причинами поздней диагностики-инфекции в далеко зашедших стадиях болезни. Все вышесказанное подтверждает актуальность проблемы и необходимость поиска новых, более точных и эффективных способов диагностики и лечения данной патологии. Известен способ диагностики вирусного гепатита С по наличиюРНК при исследовании биоптата ткани печени.(Г.М.Курманова, К.Б. Курманова, Ш.С.Садыкова Лечение хронических вирусных гепатитов препаратами цитокинов.-Пособие для врачей.Алматы.-2008.-с. 15) Недостатком данного способа является то, чтоРНК выявляется в более поздней стадии развития болезни, когда поражение печени достигает стадии хронического гепатита с переходом в цирроз,кроме того, данный способ инвазивен. Известен способ диагностики вирусного гепатита С, включающий исследование крови методом иммуноферментного анализа на наличие антител к белкам(анти-и М). При остром гепатите С преимущественно определяютсяиантитела против е-белка , при хроническом гепатите С определяются антитела классапротив структурных и нестрктурных белков вируса. Недостатком способа является то, что возможно возникновение лабораторных ошибок, связанных, в первую очередь, с нарушениями инструкций к тестсистемам,повторным использованием для постановки ИФА одноразовой или плохо вымытой многоразовой посуды, а также некачественной отмывкой планшет, что увеличивает процент несовпадающих результатов. Однако даже при соблюдении всех правил постановки ИФА часть сывороток дат противоречивый результат. Кроме того, данный способ не позволяет определить генетический тип гепатита С. Известен способ диагностики вирусного гепатита С, включающий исследование крови с определением РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).( С// .. - 2003.-.727-37) Для метода ПЦР характерна чрезвычайно высокая чувствительность, что может приводить к получению ложных результатов даже при выполнении анализа высококвалифицированным персоналом в хорошо оснащенных лабораториях. Кроме того, в настоящее время установлено, что РНК вируса не определяется в крови обследуемых лиц при низкой или неустойчивой виремии,характерной для определенных стадий заболевания, или вследствие индивидуальных особенностей организма. Данный способ также не позволяет определить генетический тип гепатита С. Задача изобретения - разработка способа диагностики вирусного гепатита С и определения генетического типа вируса. Технический результат- предлагаемый способ диагностики ВГС и определения основных генотиповпозволит на практике решать ряд задач, таких как верификация диагноза, прогноз заболевания,назначение, оценка и прогноз эффективности комплексного, в том числе противовирусного лечения,дополнительная оценка активности вирусного процесса, а также изучение широты распространения ВГС в популяции и различных группах населения. Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики вирусного гепатита С,включающем исследование крови с определением РНК вируса гепатита С,отличительной особенностью, согласно изобретению, является то,что РНК вируса в крови выделяют методом молекулярной гибридизации РНК вируса, с помощью обратной транскриптазы синтезируют соответствующую кДНК, затем анализируют последовательность специфического участка кДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных(мостиковых) олигонуклеотидов, и при наличии специфического участка генома (-43-62) анализируемую ДНК относят к вирусному гепатиту С, а для определения генетического типа вируса выявляют вариабельные зоны в 5-нетранслируемой области генома вируса гепатита С и при наличии вариабельных зон (-15022681 170) определяют генотипы и субтипы 2 а и 2, при (115 -141)генотипы и субтипы 3 а и 3, при наличии точечной мутации / (-98) - генотипы 1 а и 1. Так как на территории Казахстана для клинической практики достаточно выявить и различить три основных генотипа ВГС (1, 2 и 3) и соответствующие шесть субтипов (, , 2 а, 2, 3 а и 3). Способ осуществляется следующим образом. Забор крови производят натощак из локтевой вены в одноразовый шприц или специальную вакуумную систему 1) 5,0 мл крови из шприца аккуратно - без образования пеныпереносят в пробирку объемом 5 мл. После забора крови пробирка должна отстояться при комнатной температуре в течение 30 минут (до образования сгустка). 2) Пробирку помещают в центрифугу на 15 мин. при 3000 об/мин. 3) Осторожно переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку. Далее проводят ПЦР с использованием комплекта реагентов для генотипирования вируса гепатита С методом ОТ-ПЦР (научно-производственная фирма ДНК-технология (Россия) или АмплиСенс(РОССИЯ. Протокол проведения генотипирования ВГС с использованием ДНК-чипа. Подготовка растворов на 1 анализ В качестве матрицы используется готовый ПЦРфрагмент соответствующий 5-нетранслируемой области РНК вируса гепатита С (ВГС). Перед началом анализа размораживают,встряхивают и сбрасывают все растворы в пробирках на 1,5 мл. Для каждого раствора используют новый наконечник для пипетки. Для проведения анализа, кроме растворов данных в наборе, предварительно готовят в пробирках типа, стандартные свежие растворы 1, 2,5, 6, 8. Все приготовленные растворы должны быть встряхнуты и сброшены на центрифуге в течение 5 сек при 4000 об/мин (кроме раствора 6). Раствор 1 в пробирку 1 добавить 10 мкл раствора 1 а, 4 мкл раствора 1 б, 1 мкл раствора 1 в, встряхнуть, сбросить. Раствор 2 в пробирку 2 добавить 3 мкл анализируемого ПЦР-фрагмента,встряхнуть,сбросить. Раствор 5 в пробирку 5 добавить 1 мл раствора 5 а, хорошо встряхнуть, сбросить. Раствор 6 в пробирку 6 добавить 60 мкл раствора 6 а,тщательно встряхнуть,отцентрифугировать (5 мин. 13.2 об/мин). Раствор 8 в пробирку 8 добавить 10 мкл раствора 8 а, 10 мкл раствора 8 б, 10 мкл раствора 8 в, встряхнуть, сбросить. Постановка анализа 1. На рабочую сторону (на рабочей стороне есть пометка в нижней части) мембраны, находящуюся в пробирке 3, наносят 40 мкл раствора 1 а и тщательно распределяют раствор по поверхности. 2. Пробирку 3 ставят горизонтально в термомиксер на 5 мин при 62 С. После чего раствор из пробирки 3 удаляют. 3. Пробирку 2 ставят на 5 мин в термостат при температуре 95 С, встряхивают, сбрасывают. 4. На рабочую сторону мембраны (после пунктов 1, 2) в пробирке 3 наносят 15 мкл раствора 2 сразу после п.3, тщательно распределяют его по всей поверхности мембраны 15 мкл раствора 1, тщательно распределяют его по всей поверхности мембраны. 5. Мембрану в пробирке 3 с помощью наконечника или пинцета переворачивают рабочей стороной к стенке пробирки и прижимают. 6. Мембраной вниз пробирку 3 кладут горизонтально в термомиксер при 62 С. 7. Через 30 мин вынимают пробирку 3 из термомиксера. Промывки мембраны 8. В пробирку 3 добавляют 1 мл раствора 4,интенсивно встряхивают и удаляют жидкую фазу(Процедуру повторяют 3 раза), затем добавляют 1 мл раствора 5. Далее ее помещают в миксер на 10 мин при комн.температуре, затем удаляют из пробирки жидкую фазу. Следующим этапом добавляют 60 мкл раствора 6, раствор равномерно распределяют по всей рабочей поверхности мембраны. Мембрану прижимают рабочей стороной к стенке пробирки. При этом пробирку 3 кладут горизонтально, так,чтобы мембрана оказалась внизу, выдерживают 30 мин при комн.температуре. После чего пробирку 3 добавляют 1 мл раствора 4 помещают в миксер на 5 мин, затем удаляют жидкую фазу (Процедуру повторяют 4 раза). Последним этапом в пробирку 3 добавляют 1 мл раствора 7, интенсивно встряхивают, затем удаляют жидкую фазу. Выявление 9. Добавляют на рабочую сторону мембраны 190 мкл раствора 8. 10. Через 60 мин добавляют 20 мкл раствора 9. Считывание результатов анализа Результат анализа может быть зафиксирован при помощи обычного офисного сканера после перенесения мембраны на плоскую поверхность. Зонд в районе (-43-62), содержащий константную последовательность,выявляет любую анализируемую ДНК, относящуюся к вирусу гепатита С. Разнесение генотипов по субтипам определяют по точечными нуклеотидными заменами. Так, в 5 нетранслируемой области генома вируса гепатита С присутствуют несколько зон, по которым производят разнесение генотипов и субтипов. Выявляют следующие вариабельные зоны, по которым различают субтипы- точечная мутация / (-98) - генотипы и субтипы 1 а и 1. Все полученные олигонуклеотидные зонды имеют высокоспецифичные свойства к выявлению только правильных участков,соответствующих 3 22681 анализируемым ДНК-матрицам в условиях параллельного гибридизационного анализа. Для подтверждения эффективности предлагаемого способа были проведены клиниколабораторные исследования у 120 больных. В процессе изучения ВГС была обнаружена связь субтипов вируса с различными аспектами( С )-инфекции. Кроме того, обнаружена генотипическая приверженность ВГС к лечению. Поэтому при разработке тактики лечения гепатита С необходимым этапом является генотипирование ВГС. Из 120 исследованных больных,с подтвержденным нашим способом диагнозом ВГС, у 62 был выявлен генотип и субтип 1, что составило 51,6, у 25 больных выявлен генотип 3 а (20,8), у 12(7,5), у 7 и 5 больных выявлены генотипы и субтипы 1 а (5,8) и 3 (4,3) соответственно. Доказано, что у пациентов с генотипом 1 хронизация-инфекции происходит в 90 случаев, в то время как с генотипами 2,и 3 а, - в 33-50. Таким образом, генотип ВГС является более достоверным прогностическим фактором развития ВГС-инфекции и ответа на противовирусную терапию. Достоверно показано, что пациенты,инфицированные 1-м типом вируса, более толерантны к интерферонотерапии, чем все другие генотипы. По данным проведенного исследования,процент стойкой ремиссии на проводимую комплексную терапию -интроном и рибавирином составил в группе пациентов с 1 типом вируса 42 и 82 в группе с генотипами 2 или 3. Более того,генотипом вируса определяется и продолжительность курса лечения, что весьма актуально, учитывая широкий спектр побочных действий интерферона и низкую переносимость этого препарата больными. По литературным данным,исследования,проведенные во многих лабораториях мира,показали, что в разных странах и в разных группах риска могут доминировать различные генотипы ВГС. Знания о географическом распространении генотипов ВГС имеют большое значение как для характеристики эпидемий в том или ином регионе,так и при конкретных эпидемиологических расследованиях. Приводим клинический пример с использованием предлагаемого способа диагностики. Больной И., 34 лет. Поступил с жалобами на периодические боли в правом подреберье ноющего характера, наличие невыраженной желтухи, боли в плечевых и коленных суставах при движении,сниженный аппетит, периодическую тошноту,небольшую слабость. В анамнезе периодически имело место внутривенное введение наркотических веществ. При поступлении состояние удовлетворительное. Отмечалась субъиктеричность склер, пальмарная эритема. В легких и сердечно-сосудистой системе патологических изменений не выявлено. Живот умеренно болезненный в правом подреберье и в области пупка. Печень по средне-ключичной линии выступает на 2,0 см из-под правого края реберной дуги, мягкая, безболезненная. В общих анализах крови и мочи отклонений не выявлено. В биохимических анализах крови выявлены следующие изменения билирубин - 98,8 мк моль/л, АлАТ - 4,2 мкмоль/л, АсАТ - 2,1 мкмоль/л,ГГТП - 65 МЕ/л. По данным УЗИ органов брюшной полости признаки диффузного поражения печени. При обследовании выявлены -,. Диагностирован хронический гепатит С. При генотипированииу данного больного с использованием тест-системы ДНК-технология (Москва, Россия) и ДНК-чипа для генотипирования(лаборатория бионанотехнологий ИХБФМ,Новосибирск, Россия) получены следующие данныеобнаружен двумя методами, однако генотипне выявлен тест-системой ДНКтехнология генотип 1 идентифицирован при использовании ДНК-чипа для генотипированияна основании наличия точечной мутации (-98). С учетом выявленного генотипа и склонности к хронизации процесса больному было назначено лечение противовирусным препаратом (Интрон А). Таким образом, предлагаемый способ позволил не только диагностировать ВГС, но и определить основной генотип , сделать прогноз заболевания,назначить эффективное противовирусное лечение. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики вирусного гепатита С,включающий исследование крови с определением РНК вируса гепатита С, отличающийся тем, что РНК вируса в крови выявляют методом молекулярной гибридизации, с помощью обратной транскриптазы синтезируют соответствующую кДНК, затем анализируют последовательность специфического участка кДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных мостиковых олигонуклеотидов, и при наличии специфического участка генома -43 -62 анализируемую ДНК относят к вирусному гепатиту С, а для определения генетического типа вируса выявляют вариабельные зоны в 5-нетранслируемой области генома вируса гепатита С и при наличии вариабельных зон -150 170 определяют генотипы и субтипы 2 а и 2, при 115 -141 генотипы и субтипы 3 а и 3 при наличии точечной мутации А/ -98 генотипы 1 а и 1.