Способ лечения ожоговых ран с использованием хитозан – пектиновой подложки с культивированными аллофибробластами

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа восстановления кожного покрова у пациентов с глубокими ожогами при минимальных затратах донорской аутокожи и дорогостоящего клеточного материала,что позволяет сократить сроки пребывания данной категории пациентов в клинике и существенно снизить стоимость лечения. Технический результат достигается за счет использования в качестве подложки хитозанпектинового покрытия, полученного согласно патента 2458077(с изменением растворителя хитозана) с культивированными аллофибробластами,префиксированными на поверхности покрытия центрифугированием клеток в течение 5 минут при 200 . В результате за счет выделения аллофибробластами в раневую поверхность факторов роста, цитокинов и молекул межклеточного матрикса достигается ускорение эпителизации сетчатых трансплантатов, а высокая степень адгезии к ране хитозан-пектинового покрытия и бактерицидные свойства хитозана позволяют сократить до минимума потерю клеточного материала, предотвратить нагноение и лизис трансплантатов, а также уменьшить потребность частоты проведения перевязок.(72) Батпенов Нурлан Джумагулович Балгазаров Серик Сабиржанович Рамазанов Жанатай Кольбаевич Белан Елена Алексеевна Данлыбаева Газиза Аятбековна Жылкибаев Асылбек Айтанович Ахмадеева Жансая Тулеевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт травматологии и ортопедии Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56)93002420 , 10.09.1995 Чернова В.В. Деструкция хитозана под действием некоторых ферментных препаратов медицинского назначенияАвтореф. дисс.канд. хим. наук. Уфа, 2011, с.20(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОЖОГОВЫХ РАН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИТОЗАН ПЕКТИНОВОЙ ПОДЛОЖКИ С КУЛЬТИВИРОВАННЫМИ АЛЛОФИБРОБЛАСТАМИ(57) Изобретение относится к клинической медицине и может быть использовано при лечении глубоких ожоговых ран в комбустиологии,травматологии и хирургии. Изобретение относится к клинической медицине и может быть использовано при лечении глубоких ожоговых ран в комбустиологии, травматологии и хирургии. Известны различные способы восстановления кожного покрова. Одним из них является способ регенерации кожного покрова с использованием клеточного препарата Фиброспрей(Инновационный патент 27238, 15.08.2013, бюл. 8),заключающийся в выделении,культивировании и трансплантации клеток кожи,как аллогенных (в частности, использование штамма диплоидных эмбриональных фибробластов человека ФЭЧ 2/09 для регенеративной медицины,инновационный патент 25091 от 15.12.2011), так и аутологичных, на раневую поверхность в виде аэрозоля Фиброспрей. Клиническая эффективность применения препарата Фиброспрей проявляется за счет неспецифической стимуляции репарации эпителия,в основном за счет выделения привнесенными клетками в раневую поверхность факторов роста,цитокинов и молекул межклеточного матрикса. При ожогахстепени, донорских и длительно незаживающих ранах трансплантацию 3-4 х дневной культуры аллофибробластов осуществляли непосредственно на подготовленные в результате комплексного лечения раны. При глубоких ожогах Б -степени трансплантацию аллофибробластов сочетали с аутодермопластикой с коэффициентом расширения 14 и более. Однако способ имеет недостатки несмотря на образование на поверхности раны после трансплантации клеток пленки, неизбежна потеря дорогостоящего клеточного материала за счет адсорбции на марлевую повязку. Кроме того,использование повязок требует перевязок,вызывающих травматизацию образовавшейся пленки, а также возникновение болевой реакции. Другой способ восстановления кожного покрова включает получение так называемого дермального эквивалента,представляющего собой коллагеновый гель с включенными в его состав живыми фибробластами, на поверхности которого выращивают кератиноциты и затем такой живой эквивалент кожи пересаживают на раневую поверхностьЕ.,.,В.. -// . . . 1983 - . 81,1. - . - . 2 - 10. Такой способ восстановления кожного покрова путем пересадки живого эквивалента кожи является наиболее сложным и многоэтапным, к тому же при получении дермального эквивалента в результате функционирования фибробластов его площадь значительно уменьшается, иногда в 5 раз(контракция геля), что не позволяет получать большие по площади клеточные трансплантаты, в связи с чем данный способ имеет ограниченное применение. Известен способ применения противоожоговой гелевой композиции, состоящей из хитозана и салициловой кислоты и содержащей биорегулятор,выделенный из сыворотки крови крупного рогатого 2 скота (КРС) в низких концентрациях, который обладает выраженным репарирующим действием,что приводит к восстановлению морфологически и биохимически нормальной ткани кожи ( 2481121). Биорегулятор выделяют из сыворотки крови крупного рогатого скота - стерильного,инактивированного коммерческого препарата,используемого в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур. Однако недостатками данного способа являются длительность выделения биорегулятора из сыворотки крови (которую осуществляют путем высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония в течение 7 дней, затем проводят диализ для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония в течение 14 дней) и длительность заживления ткани (На 18 сутки в ожоговой ране после применения геля, содержащего биорегулятор сыворотки крови КРС макроскопически отмечены многочисленные фестончатые окна). Известен способ создания композиции биоразлагаемых пленок, содержащих пектин,хитозан, воду, однонормальную соляную кислоту,пластификатор - глицерин и структурообразователь- трехпроцентный раствор метилцеллюлозы ( 2458077). Одной из целей создания покрытия является возможность его использования в качестве подложки для культивирования клеток с последующим переносом их на рану. Однако использование покрытия самостоятельно ввиду возможности развития нагноения ограничивается лишь асептическими ранами - задача, практически неосуществимая при лечении глубоких ожоговых ран и обширных раневых дефектов. Кроме того,обладая высокими сорбционными свойствами, а также ранозаживляющим действием,антикоагулянтной и бактерицидной способностью Хитин и хитозан получение, свойства и применение/под ред. К.Г. Скрябина,Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М. Наука, 2002. 368 с., хитозан не способен в достаточной степени вызвать регенерацию кожного покрова при обширных ожоговых ранах в связи с отсутствием факторов роста и применение покрытий,содержащих хитозан, не может стать альтернативой аутодермопластики. Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа восстановления кожного покрова у пациентов с глубокими ожогами при минимальных затратах донорской аутокожи и дорогостоящего клеточного материала,что позволяет сократить сроки пребывания данной категории пациентов в клинике и существенно снизить стоимость лечения. Технический результат достигается за счет использования в качестве подложки хитозанпектинового покрытия, полученного согласно патента 2458077(с изменением растворителя хитозана) с культивированными аллофибробластами,префиксированными на поверхности покрытия центрифугированием клеток в течение 5 минут при 200 . В результате за счет выделения аллофибробластами в раневую поверхность факторов роста, цитокинов и молекул межклеточного матрикса достигается ускорение эпителизации сетчатых трансплантатов, а высокая степень адгезии к ране хитозан-пектинового покрытия и бактерицидные свойства хитозана позволяют сократить до минимума потерю клеточного материала, предотвратить нагноение и лизис трансплантатов, а также уменьшить потребность частоты проведения перевязок. Пример 1. Из культуральных флаконов с выросшим монослоем фибробластов (90-95 поверхности) за 24 ч до операции удаляют полную питательную среду , заменяя ее неполной средой без сыворотки. Перед использованием в матрасы с клетками вносят подогретую до 37 С смесь раствора Версена (0,02) и трипсина (0,25) в количестве, достаточном для покрытия клеточного монослоя и помещают в термостат при 37 на 3-5 мин. После округления клеток в результате действия трипсин-Версена их разбавляют необходимым количеством средыи слегка пипетируют для перевода клеток в суспензию. Суспензию клеток разводят до концентрации 1,5-2105 клеток в 1 мл питательной средой и наносят на поверхность стерильной хитозан-пектиновой подложки, после чего центрифугируют при 200 в течение 5 минут. Пример 2. Больной К., 19 лет, поступил в отделение травматологии 4 НИИ травматологии и ортопедии 15.02.2014 г. с диагнозом Последствия ожога пламенем. Обширные гранулирующие раны грудной клетки, живота, левого плеча. Ожоговая болезнь, стадия ожогового истощения (фиг.1). Травма в быту 14.08.2013 г. - ожог в результате воспламенения паров бензина. Противошоковые мероприятия проводились в ЦРБ г. Есиль. 02.09.2013 г. санитарным транспортом доставлен в Акмолинскую областную больницу. На протяжении всего периода лечения было проведено 5 аутодермопластик с последующим лизисом трансплантатов. В связи с отсутствием положительной динамики доставлен санитарным автотранспортом в НИИ травматологии и ортопедии, госпитализирован в плановом порядке в отделение травматологии 4. 21.02.14 г. произведена операция свободная аутодермопластика расщепленными трансплантатами гранулирующих ран грудной клетки, живота, левого плеча. На поверхность помещенных на гранулирующие раны передней поверхности грудной клетки, живота,левого плеча сетчатых трансплантатов помещены хитозан-пектиновые покрытия с префиксированными на поверхности культивированными аллофибробластами, наложены фиксирующие повязки с физиологическим раствором (фиг.2). Перевязка произведена на 4 сутки адгезия покрытий к ранам в области ячеек трансплантатов удовлетворительная,раневое отделяемое отсутствует. На 7 сутки фиксирующие повязки удалены, в дальнейшем проводилось открытое ведение с обработкой маслом Кызыл-май. На 10 сутки хитозан-пектиновые покрытия удалены, под ними наблюдалась полная эпителизация ячеек сетчатых трансплантатов. Выписан в удовлетворительном состоянии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ лечения ожоговых ран, включающий использование культуры аллофибробластов,отличающийся тем, что на поверхность сетчатых аутотрансплантатов культивированные аллофибробласты привносят,предварительно префиксированными на поверхности хитозан пектиновой подложки в количестве не менее 50 тысяч клеток на 1 см 2.