Способ получения термостабильной ДНК полимеразы бактерии Thermus aquaticus Taq-pol с помощью рекомбинантного штамма Esсhherichia coli BL21(DЕЗ) /pTPh

(51) 12 1/68 (2006.01) 12 1/21 (2006.01) 12 15/09 (2006.01) 12 15/11 (2006.01) 12 15/63 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ этим актуально получение рекомбинантной полимеразы путем модификации целевого фермента генно-инженерным способом и экспрессии гена в гетерологичном окружении в бактериальных клеткахи в использовании сильных фаговых промоторов, обеспечивающих высокий уровень синтеза целевого белка. Технической задачей изобретения является получение термостабильной-полимеразы бактериина основе генноинженерного штамма, в котором ген-полимеразы встроен под контроль промотора бактериофага Т 7, а целевой рекомбинантный белок выделяется с помощью металлоаффинной хроматографии на ионах никеля 2. В результате, получена термостабильная полимераза с помощью штамма - продуцента 21(3)/, созданного генноинженерным способом, обеспечивающего высокий уровень синтеза рекомбинантного целевого белка в клетках. Очистка белка-полимеразы осуществляется металлоаффинным способом на ионах 2. Полученный белок обладает ферментативной активностью в отношении дезоксирибонуклеиновых кислот полимеразной активностью в направлении 5-3 и эндонуклеазной активностью в направлении 5-3. Активность полимеразных свойств белка представленного в буфере хранения определялась методом полимеразной цепной реакции и составила 2 единицы на один микролитр (ед/мкл).(72) Абельденов Сайлау Касенович Кирибаева Асель Калиаскаровна Абдуллаева Алия Нурниязовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Хасенов Бекболат Бауржанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ БАКТЕРИИС ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА С(57) Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биотехнологии. Может быть широко использовано в качестве фермента в полимеразной цепной реакции. Известны несколько работ по выделению и очистке ДНК-полимераз из природных штаммов термофилов, таких как. Основным недостатком этих методов является низкий уровень выделения белков из их природных источников и сложность очистки от примесных белков. В связи с Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биотехнологии, может быть применено в качестве фермента в полимеразной цепной реакции, используемой в научных исследованиях, в области молекулярной биологии и диагностической практике. Получена термостабильная ДНК полимераза бактерии с помощью рекомбинантного штамма - продуцента 21(3). Штамм-продуцент создан на основе штамма 21(3) путем трансформации оригинальным плазмидным вектором , несущим полноразмерный генсодержащего дополнительный олигонуклеотид,кодирующий полигистидиновую метку. Изобретение позволяет получить рекомбинантную-полимеразу до 30000 единиц (3,6 мг из 1 литра среды), обладающую полимеразной активностью и эндонуклеазной активностью в направлении 5-3. Известны несколько работ по выделению и очистке ДНК-полимераз из природных штаммов термофилов, таких как( .. (1976), . . 1271550-1557 Патент США 4889818). Одним из недостатков указанных методов является низкий уровень выделения белков из природных источников и сложность очистки от примесных белков. В связи с этим актуально получение рекомбинантной -полимеразы путем модификации целевого фермента генноинженерным способом и экспрессии гена в гетерологичном окружении в бактериальных клетках. Авторами (., 2009) сконструирован вектор с интегрированным геном 1, являющимся модифицированным вариантом большого фрагмента. Данная конструкция несет чувствительный к температуре промотор от бактериофага лямбда и химически индуцибельный лямбда-репрессор. Трансформация штаммовпозволила получить штаммпродуцент с выходом фермента 1 до 12 от общего клеточного белка, что составляет 3 мг очищенного фермента с 1 грамма мокрых клеток. Основным недостатком данной системы экспрессии является высокий базовый уровень экспрессии, обусловленный тем, что промотор является холодоиндуцибельным. Выбор экспрессионного штамма определяется используемым в работе вектором. Наиболее близким по технической реализации аналогом изобретения является описанный в патенте США 6083686 ( А. , 2000) способ получения-полимеразы в клетках 103 на основе вектора 56. Преимущество предлагаемого метода в данном изобретении штамма 21(3) заключается в использовании бактерии с пониженным уровнем протеолитического расщепления рекомбинантного белка и загрязнения выделяемого белка наиболее активными протеазами. Дополнительным преимуществом является наличие с -конца результирующего белка 2 дополнительного полипептида,содержащего шестимерную гистидиновую метку слитой с белком- посредством серин-глицинового шарнира. Использование плазмидного векторапозволяет получать-полимеразу с высокой ферментативной активностью до 30000 единиц(3,6 мг из 1 литра среды), обладающую полимеразной и эндонуклеазной активностью в направлении 5-3. Технической задачей изобретения является получение термостабильной-полимеразы бактериина основе штаммапродуцента 21(3)/,выделяемой с помощью металлоаффинной хроматографии на ионах никеля 2. Сущность изобретения поясняется следующими примерами конкретного выполнения изобретения путем решения задачи в два этапа 1. Получение штамма-продуцента 21(3)/. Штамм-продуцент 21(3)/ получают методом электропорации компетентных клеток 21(3) плазмидой ,несущей полноразмерный ген -, содержащий дополнительный олигонуклеотид(60 пар оснований) кодирующий шестимерную гистидиновую метку под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т 7. Трансформанты отбирают на среде с канамицином, изменение генотипа определяют методом ПЦР на тотальной ДНК с помощью праймеров специфичных к гену-. Для культивирования штамма 21(3)/ использовали среду Луриа-Бертани, содержащую в расчете на 1 литр бактериологический триптон (10 г), бактодрожжевой экстракт (5 г) и(5 г), стерилизация при 121 С - 30 минут. Культивировали при температуре 37 С и встряхивании 120-180 оборотов в минуту в присутствии канамицина в концентрации 50 мкг/мл до оптической плотности 6000,6. После добавляли активатор индукции промотора ас-оперона изопропил 1 тиогалактопиранозид в концентрации 0,5 мМ и инкубировали 16 часов при 30 С и встряхивании 120 об/мин. Культуру проверяли на способность продуцировать -полимеразу. Условия хранения штамма на криосохранении при -80 С в 50 среде и 50 глицерине, концентрация клеток 109 КОЕ/мл, лиофильно высушенные образцы - при температуре 4 С, -20 С, -40 С и -80 С в течение 10 лет, криоконсервированные образцы - при температуре хранения -80 С, в течение 10 лет. Полученный штамм-продуцент 21(3)/ характеризуется следующими признаками Среда, температура, возраст, условия роста среда, 37 С, 120 , 16 ч. Морфологические признаки палочки 1,1-6 мкм,грамотрицательные, спор и цисты не образует,кислотонеустойчивы,подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Культуральные признаки при росте на агаризованной средеколонии округлые, с ровными краями, консистенция мягкая, с блеском. Диаметр колоний 1 мм, цвет поверхности - светлокоричневый. Рост в жидкой среде сопровождается появлением резкого запаха, помутнением среды. Физиолого-биохимические признаки температурный оптимум для роста клеток 30-37 С,оптимум 7,2-7,4, тип размножения - бинарное деление, агрегаты клеток - одиночные или парами. Устойчивость к антибиотикам клетки проявляют устойчивость к канамицину, обусловленную наличием в плазмиде гена . Принадлежность к трофической группе хемогетеротроф. Тип катаболизма дыхание, брожение. Отношение к кислороду факультативный анаэроб. Размер генома, наличие и характеристика плазмид Генотип -(3 5-71 1 7 5) . Содержит плазмиду(7803 п.н.). Дифференцирующие компоненты клеточной стенки индол, ацетилметилкарбинол (ацетоин), лимонная кислота, лактоза. Дифференцирующие антигены О- и К-антигены. Полученный штамм-продуцент 21(3)/ депонировали в Депозитарии ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,регистрационный номер, присвоенный коллекцией В 492. 2. Наработка и хроматографическая очистка белка. Для наработки белка замороженную культуру рекомбинантного штамма вносили в бульон ЛуриаБертани, содержащий антибиотик канамицин(50 мкг/мл) и инкубировали при интенсивном встряхивании при температуре 37 С до достижения середины логарифмической фазы роста. После чего для индукции промотора вносили изопропилтиогалактопиранозид в финальной концентрации 0,5 мМ. После 2-16 часовой инкубации клетки собирали, лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Далее лизат инкубировали при 75 С в течение 1 часа. Нерастворимая фракция клеточного дебриса была удалена с помощью центрифугирования в течение 1 часа при ускорении 40000, температуре 4 С. Конечную очистку проводили методом металлоаффинной хроматографии с использованием сорбента сефарозы активированной ионами 2. Полученный белок ресуспендировали в буфере для хранения (100 мМ КС 50 мМ - ( 8,0) 0,1 мМ( 8,0) 0,5 мМ 1 Х 100 и 50 (по объему) глицерин) и хранили при температуре -20 С. Молекулярная масса полученного рекомбинантного аналога-полимеразы соответствует 96,1 кДа. Полная аминокислотная последовательность насчитывает 852 аминокислотных остатка Подчеркиванием выделен полипептид, содержащий гистидиновую метку и серин-глициновый шарнир. Выход целевого белка - составляет 3,6 мг из 1 литра среды, что составляет 30000 единиц активности. Рекомбинантный белок обладает ферментативной активностью в отношении дезоксирибонуклеиновых кислот полимеразной и эндонуклеазной активностью в направлении 5-3. Тестирование проводилось электрофорезом в СДС полиакриламидном геле ( 4 // . - 1970. - . 27. - . 680685). Концентрация белка определялась колориметрическим методом по Бредфорду( М.М.- . . . 1976 72 .248-254). Активность полимеразных свойств белка - определялась методом полимеразной цепной реакции. Таким образом,достигнут технический результат, а именно получена термостабильная полимераза, имеющая отличие от аналогов наличием дополнительного аффинного домена,облегчающего процесс очистки с помощью штамма продуцента 21(3)/, созданного генно-инженерным способом, несущего полноразмерный ген -,содержащего дополнительный олигонуклеотид (60 пар оснований) для кодирования шестимерной гистидиновой метки под контролем промотора РНКполимеразы бактериофага Т 7, что дает в свою очередь высокий уровень синтеза целевого белка. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения термостабильной ДНК полимеразы бактерии- с помощью рекомбинантного штамма,отличающийся тем, что используют генно 3 хроматографию на ионах 2.