Способ получения гранулоцито-макрофагового фактора стимуляции колоний

2 белка, микроорганизмы и клеточные линии, трансформированные указанными векторами, и ФЬКбелок полученный таким образом. Второй аспект изобретения обеспечивает способ выделения и очистки ФСКбелка из природных или рекомбинантных источников Иочищенный таким образом ФСК-белок, имеющий степень чистоты и уровень активности выше тех, что были описаны ранее. Предпосылки изобретения Найдено, что многие различные типы клеток крови происходятиз гематопоэтическнх стволовых клеток. Стволовые клетки выполняют две функции (1) они репродуцируют сами себя, в результате чего поддерживается популяция стволовых клеток в организме и 2) они обеспечивают потомство клеток, предназначенных для дифференцировки в один из видов зрелых клеток крови. Клетка, которая вступает в дифференцировку по конкретному кроветворному пути,называется клеткойпредшественником. Клетки-предшественники для Тлимфоцитов, Влимфоцитов гранулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и эозинофилов, так же, как н более ранние предшественники, КОТОРЫЕ МОГУТ индивидуально давать начало НЕКОТОРЫМ типам зрелыхклеток, были экспериментально изучены как 1 п ч 1 ч 0 , так и 1 п чйго (Вехгещ т.м. 1983, 3 Рато 1 о 9 у 141,415-433. Было определено 1 П Ч 1 гО , что пролиферацияи/или дифференциация предшественника каждого типа клеток зависит от определенных факторов, которые происходят из различных источников. Например, поздние предшественники эритроцитов требуют фактора, называемого эритропозтином. Факторы, требующиеся для выживания, пролиферации и дифференцировки миелоидных предшественников, переходящих в форму зрелых нейтрофильных гранулоцитов, мо ноцитов-и зрелых макрофагов, называют факторами стимуляции коло 5402ФСК активность зкстенсивно изучалась на мышах. Большинство органов взрослых мышей продуцирует ФСК активность. Однако, композиции, содержащие ФСК активность, которые были получены изЙбиохимическим характеристикам. Так, неизвестна структурная вза имосвязь между различными факторами. Более того, ФСК активность действует на более, чем одной стадии развития гранулоцита и макрофага, и не известно даже, единственный ли фактор является ответственным за все наблюдаемые активности или же на каждой стадии действуют различные факторы. ( Вцг 9 езз А. и Меса 1 Е Д. 1980 В 1 ооа 56, 947-957).Человеческая ФСК активность была получена из плаценты, некоторых тканей плода, макрофагов и стимулироваиных Тклеток. Линия Тклеток (Мо), которая продуцирует одну или несколько мощных ФСК активностей, была получена от пациента с Тклеточным вариантом волосатой клетки лейкемии (лейкемическнй ретикулоэндотелиоз) Водите е а 1. 1978, Ыоо 52, 1068-1072).Способность СК активности стимулировать образование гранулоцитов и макрофагов указывает на то, что фармацевтические композиции, обладающие ФСК активностью, являются клинически полезными в ситуациях, когда требуется повышенное продуцирование таких типов (миелоидных клеток. Действительно, показано, что некоторые пациенты с крайне высокими уровнями, по-видимому, нормальных циркулирующих гранулоцитов имеют опухоли, которые сверхпродуцируют ФСК. И только при хирургическом удалении опухоли количество гранулоцитов быстро возвращается к нормальному уров ню, четко подтверждая, что ФСК может быть полезным при регулиро 54024 вании количеств циркулирующих гранулоцитов. НосК 1 п 9, И., Соодтапг 5-р и С 01 де , Д., В 1 ооа , 61, 600 /1983/). В частности, ФСК композиции являются клинически полезными дляем рака или его лечением с помощью облучения. Кроме того, ФСККОМПОЗНЦИН ЯВЛЯЮТСЯ ПОЛЕЗНЫМИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СИЛЬНЫХ ИНФВКЦИЙ, ПО тому что ФСК может увеличивать и/или активировать пул гранулопитов и/или моноцитов.Имеются разные четко различающиеся типы известных ФСК активностей, включая гранулоцит ФСК (Б-ФСК, макрофагФСК (Мт ФСК), гранулоцитмакрофаг ФСК (еМФСК) и мульти-ФСК. Настоящее изобретение в частности относится к еМФСК. ФСКбелки известных для различных животных источников. Однако, настоящее изобретение в частности относится к ФСК приматов, более конкретно к ФСК человека и к ФСК человекообразной обезьяны.Биологическая и биохимическая характеристика композиций,обладающих ФСК активностью, и изучение этих композиций в клинических условиях было затруднено до настоящего времени недостаточным количеством и загрязненностью ФСКкомпоэиций человека и/или других приматов. Следует иметь в виду необходимость идентифицировать белок или белки, ответственные за ФСК активность. Кроме того, желательно иметь приметный, в частности человеческий источник такого ФСК который может легко обеспечить потребность в таких белках, причем в таких количествах и такой чистоты, которые достаточны для биологической и биохимической характеристики и для использования их в качестве терапевтических агентов.РЗЗРЭОТЗННЬЪЕ ранее МЕТОДИКИ молекулярного КПОННРОВЗНИЯ ПЕлают возможным клонирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, и получение такого белка в достаточном количестве, используя подходящую систему хозяинвектор, т.мат ниатис Молекулярное клонирование Лабораторное руководство, Колд Спринг Харбор лаборатори Колд Спринг Харбор Н.И.1982 г..Затем белок может быть извлечен по известным методикам выделенияи очистки. Методы клонирования, используемые до настоящего времени, могут быть сгруппированы в три основные категории(1) способы, основанные на знании структуры белка, например, его аминокислотной последовательности (2) способы, основанные на идентификации белка, экспрессированного клонированным геном, с использованием специфического к такому белку антитела и(3) способы, основанные на идентификации видов РНК, которые могут быть транслированы для получения белка или активности, кодируемых интересующим геном.Каждый из этих классов способов становится трудным для применения, когда интересующий белок, такой как ФСКбелок, доступен в очень малом количестве. Следовательно, если трудно получить адекватное количество очищенного белка, то трудно и определить аминокислотную последовательность или даже частичные последовательности белка. подобным образом, идентификацию зкспрессирован ного белка связывающим антителом желательно проводить, используя поликпональную антисыворотку с высоким титром. такая антисыворотка не может быть получена при отсутствии достаточных количеств чистого белка (антигена). Альтернативная попытка связана с моноклональным антителом, но требуемое антитело также может быть получено с большим трудом при отсутствии подходящего антигена итакое МОНОКЛОНЗЛЬНОЕ антитело МОЖЕТ не ВЗЗИМОДЭЙСТВОВЗТЬ С белком