Способ определения группы крови человека методом ПЦР в реальном времени

(51) 12 15/11 (2006.01) 12 15/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ классическим методом,основанном на серологическом анализе. Применение данного способа определения группы крови позволит предотвратить развитие гемолитических осложнений при гемотрансфузионной терапии,что особенно актуально для больных анемией и другими аутоиммунными заболеваниями. В перспективе,данный способ позволит уменьшить риск неправильного подбора донора и последующего несоответствия групп крови при переливании. Способ основан на генотипировании трех полиморфизмов гена гликозилтрансферазы АВ 0(261, 796 и 803) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, что позволяет определять группу крови АВ 0 с точностью до 99,5. Способ определения группы крови человека методом ПЦР в реальном времени может быть использован в здравоохранении, в медицинских учреждениях различного профиля, в частности, в центрах переливания крови и диагностических центрах РК.(72) Тарлыков Павел Викторович Жолдыбаева Елена Витальевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ(57) Изобретение относится к медицине, в частности,к трансфузиологии,а именно,определению группы крови системы АВ 0, и может быть использовано для выявления ошибок при определении групповой принадлежности Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к медицине, в частности,к трансфузиологии,а именно,определению группы крови системы АВ 0, и может быть использовано для выявления ошибок при определении групповой принадлежности классическим методом,основанном на серологическом анализе. Применение данного способа определения группы крови позволит предотвратить развитие гемолитических осложнений при гемотрансфузионной терапии,что особенно актуально для больных анемией и другими аутоиммунными заболеваниями. В перспективе,данный способ позволит уменьшить риск неправильного подбора донора и последующего несоответствия групп крови при переливании. Известно, что ошибки при определении групповой принадлежности крови создают серьезные предпосылки для развития осложнений при переливании. Частота острых гемолитических осложнений в среднем составляет 1 на 12 тыс. трансфузийЕ. . -// . - 2008. - . 319, 5869.-. 14781479. Фатальные гемолитические осложнения встречаются с частотой 1 на 100 тыс. переливаний. Несовместимость по группе АВ 0 составляет примерно 83 от всех фатальных острых гемолитических осложнений. При этом летальность в результате несовместимых по системе АВ 0 трансфузий составляет в Великобритании 1 на 10 случаев несовместимых трансфузий, в США -1 на 18, в России - 1 на 3,9,, 0//. - 2012. - . 19,6. . 475-479.М.,.0//. - 2003. - . 17,1, - . 57-68. Летальность гемолитических осложнений в Казахстане неизвестна, так как данная статистика не ведется. Точный анализ частоты встречаемости острых гемолитических осложнений затруднен, поскольку в трансфузиологической практике, как в нашей стране, так и за рубежом, ряд осложнений скрывается, или маскируется под видом других диагнозов. Уровень техники. В настоящее время существует несколько способов генотипирования гена гликозилтрансферазы,непосредственно участвующего в формировании группы крови человека. К ним относятся секвенирование нуклеотидной последовательности гена,рестрикционный анализ, ДНК-анализ на чипах и некоторые другие методы, основанные на полимеразной цепной реакции(аллельспецифическая ПЦР, анализ кривых плавления,метод конкурирующих такман зондов). В настоящем изобретении предлагается использование метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, который является наиболее быстрым,удобным и достаточно точным для применения в центрах переливания крови. Аналоги изобретения. В результате проведенного патентного поиска на веб-ресурсах//,содержащих реестр казахстанских, евразийских и российских патентов,способов определения группы крови человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени найдено не было. Тем не менее,похожие работы описываются в зарубежной литературе. В качестве примера можно привести исследование японских ученых, опубликованное в 2013 году.,.,.. 0//. - 2013. -. 15, 2. -. 57-60 Авторы показали, что для определения групповой принадлежности в японской популяции можно использовать генотипирование полиморфизмов гена гликозилтрансферазы АВ 0 с помощью метода ПЦР в реальном времени. Этот способ избран нами в качестве прототипа. Отличительными признаками данного способа от прототипа является измененная панель исследуемых полиморфизмов в экзонах 6 и 7 гена АВ 0. В прототипе рассматриваются 8 полиморфизмов,характерных для японской популяции (261, 297,467, 657, 703, 829, 930 и 1061), которые являются недостаточно информативными для населения Средней Азии, т.е. не всегда позволяют точно определить группу крови. На основе проведенных исследований, нами была предложена панель,состоящая из трех полиморфизмов (261, 796 и 803). Выявление данных полиморфизмов, характерных для населения Казахстана, позволяет с высокой точностью определять группу крови АВ 0. Сущностью изобретения является определение группы крови АВ 0 человека с помощью ПЦР в реальном времени для выявления ошибок при определении групповой принадлежности классическим методом. Как известно, основное условие для безопасного переливания крови это совместимость красных кровяных телец по группе крови АВ 0. Этнически различные популяции имеют различные спектры и уровень встречаемости полиморфизмов гена гликозилтрансферазы АВ 0. На сегодняшний момент в научной литературе не встречались публикации по исследованию полиморфизмов гена АВ 0 у населения Казахстана и Центральной Азии. Применение данного способа позволяет с высокой вероятностью предсказать развитие гемолитических осложнений при гемотрансфузионной терапии и тем самым уменьшить встречаемость таких осложнений и смертность в целом. Задачей изобретения является разработка способа для определения группы крови АВ 0 человека с помощью ПЦР в реальном времени для выявления ошибок при определении групповой принадлежности классическим методом. Технический результат. Результатом является способ генотипирования гена гликозилтрансферазы АВ 0 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с помощью специфичных праймеров и конкурирующих зондов. Предложенная панель, состоящая из трех полиморфизмов гена гликозилтрансферазы АВ 0(261, 796 и 803), позволяет определять группу крови АВ 0 у населения Казахстана с точностью до 99,5. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Используя предлагаемый способ, нами была определена групповая принадлежность по системе АВ 0 у 369 человек с известной группой крови. Изначально,групповая принадлежность определялась с помощью обычного серологического метода в центре переливания крови. Фенотипы 369 образцов выглядели следующим образом группа крови А(99), В (93), 0 (132) и АВ (45). Далее выделяли ДНК классическим методом высаливания и проводили секвенирование экзонов 6 и 7 гена АВ 0 методом прямого секвенирования. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена АВ 0 с последовательностью 020469.2(Национальный центр биотехнологической информации США) отбирались наиболее информативные полиморфизмы для данной популяции. В результате было отобрано три полиморфизма гена гликозилтрансферазы АВ 0 (261,796 и 803), на которые были подобраны праймеры и конкурирующие зонды для проведения ПЦР в реальном времени. Группа крови определялась следующим образом. Наличие делеции гуанина в 261 положении гена гликозилтрансферазы АВ 0 (261) в гомозиготном состоянии приводит к однозначному определению группы крови. Среди гетерозигот по 261 носители аллеля 796 А как в гетеро-, так и в гомозиготной форме относятся к группе крови В, а носители аллеля 796 С - к группе крови А, группа крови АВ в данном случае невозможна. При отсутствии делеции в 261 положении в гомозиготном состоянии группы крови определяются по наличию мутации С 796 А генотип С/С - группа крови А и 0, генотип С/А и генотип А/А - группа крови В и АВ. В позиции 796 дикий тип (С) в показывает 0 либо А и на 100 исключает АВ. Замена С на А на 100 исключает группы 0 и А и показывает группу В. Гетерозигота С/А также на 100 исключает 0 и А. В позиции 803 заменана С на 100 исключает 0 и А и показывает группу В. Анализ результатов генотипирования полиморфизмов в образцах с известной группой крови показал, что точность определения группы крови человека методом ПЦР в реальном времени достигает 99,5 (367 из 369 человек). В двух оставшихся случаях можно предположить наличие редких аллелей, которые маскируют группу крови. В тоже время встречаемость таких образцов составила менее 1 от общего количества правильно определенных групп крови. Таким образом, генотипирование трех полиморфизмов гена АВ 0 (261, 796 и 803) является достаточным для идентификации основных генотипов АВ 0,встречающихся у населения Казахстана. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения группы крови человека,включающий генотипирование методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем,что у лиц казахской национальности проводят генотипирование трех полиморфизмов гена гликозилтрансферазы АВ 0 (261, 796 и 803), и,при наличии делеции гуанина в 261 положении гена гликозилтрансферазы АВ 0 (261 ) в гомозиготном состоянии, определяют группу крови 0,- среди гетерозигот по 261 у носителей аллеля 796 А как в гетеро-, так и в гомозиготной форме определяют группу крови В,- у носителей аллеля 796 С определяют группу крови А при отсутствии делеции в 261 положении в гомозиготном состоянии группы крови определяют по наличию мутации С 796 А- генотип С/С - группа крови А и 0,- генотип С/А и генотип А/А - группа крови В и АВ при наличии в позиции 796 дикого типа (С) определяют 0 либо А и исключают АВ,- при замене С на А исключают группы 0 и А и определяют группу крови В,- у гетерозигот С/А также исключают 0 и А в позиции 803 при заменена С исключают 0 и А и определяют группу крови В.