Биологический препарат для очистки нефтезагрязненных почв

(51) 09 1/10 (2006.01) 12 1/26 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ территорий с использованием биопрепаратов с высоким содержанием жизнеспособных клеток активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, удобных в использовании и длительным сроком хранения является одним из приоритетных направлений охраны окружающей среды. Техническим результатом является получение стабильной формы биологического препарата на основе активного штамма нефтедеструктора В 12,путем суспендированной биомассы микроорганизмов в водном растворе 1 глицерина и 10 хлорида натрия. Данная форма стабильна и может храниться более 6 месяцев при низких положительных температурах, при этом эффективность препарата при обработке нефтезагрязненной почвы не снижается.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Молдагулова Назира Балтабаевна Сарсенова Айнур Сейтжаппаркызы Аюпова Айгуль Жанаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биоремедиации нефтезагрязненной почвы и воды. Используется для очистки водной и почвенной экосистем для очистки от нефтяных загрязнений. Повышение эффективности очистки загрязненных нефтью и нефтепродуктами Изобретение относится к экологической биотехнологии, в частности к биотехнологическим способам биоремедиации нефтезагрязненных почв путем внесения биологического препарата на основе активного штамма - нефтедеструктора и может быть использовано для очистки нефтезагрязненных почв. В настоящее время проблеме загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами уделяется большое внимание. Одним из эффективных методов биоремедиации нефтезагрязненных почв и воды является биологический метод с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов. Биологическая очистка почв позволяет не только очищать почву, почвогрунты и почвогрунтовые воды от нефтепродуктов, но и предотвращать дальнейшее распространение загрязнения на прилегающую территорию Танский С.И.,Толстова Ю.С. // Инф.бюл. ВПС МОББ. 1985. 8. с.7-17 Скворцова М. М., Елизарова Н.А.//Микробиологическая промышленность. - 1972. 12 (96). с.22-25. Известен бактериальный препарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (Патент 2138451, МПК В 09 С 1/10),включающие аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. Известен биопрепарат Путидойл,предназначенный для ускорения разложения нефти(А.с.1076446, кл. 02 3/34, 1984). Данные биопрепараты представлены в виде сухой биомассы микроорганизмов, обезвоженных с использованием лиофильной или термовакуумной сушки. К достоинствам этой формы препаратов относится длительность их хранения. Однако по результатам многих исследований в высушенной сухой микробной биомассе выживаемость клеток бактерий составляет не более 50 Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при различных способах хранения биомассы / К.В. Петриков и др. // Изв. ТулЕУ. Естественные науки. 2008. Вып.2. с.226-237. К тому же сушка микробных клеток - это достаточно энергоемкий процесс, что отражается на себестоимости препаратов. Кроме того, после лиофилизации микроорганизмы могут потерять свои полезные свойства. Также сухой препарат требует подготовки к работе, т.к. микроорганизмы необходимо реактивировать, для чего требуется специальная техника и специалист-микробиолог. Наиболее удобной для использования является жидкая форма биологических препаратов. Она намного дешевле сухих форм биопрепаратов, не требует специальной подготовки для применения. При этом в жидкой форме выживаемость бактериальных клеток составляет более 90. Однако жидкие формы препаратов не предназначены для длительного хранения. Титр клеток через месяц хранения резко снижается, так как для поддержания жизнеспособности клеток микроорганизмов необходим кислород воздуха. Для 2 поддержания жизнеспособности клеток в препараты добавляются различные защитные вещества. Наиболее близким аналогом к настоящей разработке является биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, известный по Патенту 2365438 С 2. Препарат представлен в жидкой форме и содержит в (мас.) глицерин 8-10,3-0.360-0.367,КН 2 РО 4-0.054-0.055,24122-0.126-0.128,нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-1010 кл/мл препарата и воду. Недостатком метода является то, что препарат необходимо хранить при низких температурах (не выше-10 С), при этом срок хранения препарата менее 2 месяцев. Задачей изобретения является получение стабильной формы биопрепарата-нефтедеструктора с высоким титром жизнеспособных клеток и длительным сроком хранения. Технический результат - получение стабильной формы биологического препарата на основе активного штамма нефтедеструктораВ 12. Поставленная задача решается тем, что биопрепарат готовят в виде суспензии биомассы клеток в растворе 10-гои 1 глицерина. Хранение препаратов можно осуществлять и при комнатных температурах, что намного облегчает процесс перевозки препаратов,удешевляет стоимость его хранения. Глицерин широко применяется в качестве криопротектора бактериальных клеток, это недорогое и доступное вещество. Кроме защитных функций бактериальных клеток от стрессов, глицерин балансирует осмотическое давление и регулирует трансмембранный транспорт, что решает проблему возможности проявления осмотического шока. Дыхательная активность снижается за счет высокой солености среды. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1. Приготовление препарата. ШтаммВ 12 выращивают в 250 мл колбе на сухом питательном бульоне. Можно также использовать и консорциумы микроорганизмов. Полученную культуральную жидкость центрифугируют при 7000 об/мин. Далее осадок промывают 1 раствороми центрифугируют. Для формирования биопрепарата осажденную биомассу растворяют в 10 растворес добавлением 1 глицерина. Пример 2. Биопрепарат, полученный по методике описанной выше хранили при температуре-10 С и при 4 С, в течение 6 месяцев. Каждый месяц определяли титр клеток методом Коха. Выживаемость клеток штамма В 12 в водных растворахс добавлением 1 глицерина через 6 месяцев хранения определяли по отношению значения десятичного логарифма титра клеток в препарате после хранения к значению десятичного логарифма начального титра клеток бактерий. Пример 3. В плашки размером 1015 см помещали по 200 г почвы, загрязненной нефтью до концентрации 10 г/100 г. В плашки вносили по 2 мл биопрепарата, приготовленного, как указывалось в примере 1, почву увлажняли водой до 60 полной влагоемкости почвы. Инкубировали в течение 2 месяцев при температуре 25 С. Очищаемую почву регулярно перемешивали, влажность поддерживали на начальном уровне. Степень деструкции нефтепродуктов определяли после 60 и 90 суток эксперимента (таблица 2). В качестве контроля использовали плашки с нефтезагрязненной почвой без внесения препарата. Пример 4. Нефтеокисляющую активность свежеприготовленных препаратов после 6 месяцев хранения определяли в лабораторных условиях на минеральной среде Ворошиловой - Диановой с 3 нефтью. Опыты проводили в 250 мл колбах, в которые заливали по 100 мл среды Ворошиловой - Диановой и добавляли 3 г нефти. Далее в колбы вносили по 0,1 мл препарата и ставили на качалки при температуре 28 С при 150 об/мин. Содержание нефти определяли методом ИК-спектроскопии на 7 день культивирования микроорганизмов (таблица 3). Таблица 1 Выживаемость клеток штаммаВ 12 в водных растворахс добавлением 1 глицерина через 6 месяцев хранения Температура хранения препарата Нефтеокисляющая активность препаратов в почве Варианты Таблица 3 Нефтеокисляющая активность свежеприготовленных препаратов и после 6 месяцев хранения Варианты Таким образом, получена стабильная жидкая форма биопрепарата - нефтедеструктора, которая может храниться при низких положительных температурах более 6 месяцев. При этом деструкция нефти после 6 месяцев хранения повышается на 19, что объясняется эффектом голодания клеток микроорганизма. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологический препарат для очистки нефтезагрязненных почв, включающий клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, 0,21 глицерин,минеральные соли и воду,отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов используют штаммВ 12. 2. Биоперпарат по п.1, отличающийся тем, что для снижения дыхательной активности клеток микроорганизмов добавляют 10 раствор хлорида натрия. 3. Биоперпарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве осмопротектора используют 1 глицерин. 4. Биоперпарат по п.1, отличающийся тем, что его можно хранить и перевозить при температуре 45 С.