Препарат “бакойл-kz” для очистки почв от нефти и нефтепродуктов

(51) 12 1/20 (2010.01) 09 1/10 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии,экологии и может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью нефтеокисляющих бактерий. Препарат для очистки почв от нефти и нефтепродуктов включает аэробные нефтеокисляющие бактерии и адсорбенты. Отличается тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий он содержит ассоциацию бактериальных штаммов 40 и 34,7 А,адсорбированную на бентоните. Техническим результатом является получение бактериального препарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий 40 и 34,7 А, адсорбированных на бентоните для повышения их активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Инновационный патент РК 22177 Консорциум штаммов 2 А и 41-3, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, кл. 12 1/20, 12 1/26, 09 1/10, 2010(54) ПРЕПАРАТ БАКОЙЛ- ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Изобретение относится к области биотехнологии,экологии и может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью нефтеокисляющих бактерий. В настоящее время для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений используются биопрепараты на основе активно разлагающих нефть микроорганизмов бактерий родов, , , дрожжей , нитевидных актиномицетов , грибовии др. Имеются разнообразные биопрепараты,разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений (коммерческие названия препаратов Авачон,Бациспенин,Валентис,Деворойл,Достроил, Нафтокс, Никаойл, Петролан, Путидойл,Родер, Универсал и др.). Самыми известными из них и давно применяющимися на практике являются биопрепараты Путидойл и Деворойл (Демьяненко А Ф., Мизгирев Н.С. Микробиологическая очистка грунтов от нефтепродуктов в закрытых реакторах изотермического типа // Вестник ВНИИЖТ, 2005,6). В последнее время все чаще производят сорбированные препараты. Иммобилизация клеток на носителе, помимо их закрепления в загрязненной почве, может повысить эффективность препарата,поскольку иммобилизованные клетки значительно более устойчивы к неблагоприятному воздействию окружающей среды. Препарат бактериальный Эконадин (ТУ У 30171732-001-2000, регистрация в Госстандарте 11.09.2000,095/004466) изготовлен на основе бактерий - деструкторов углеводородов нефти,иммобилизованных по специальной технологии на органическом субстрате - торфе. Разработана сухая форма препарата Экосорб, в котором бактериальные клетки иммобилизованы на сорбенте лессорб - продукт термической обработки растительного материала (мох и древесина) (В. П. Холоденко, В. А. Чугунов, С. К. Жиглецова и др. Разработка биотехнологических методов ликвидации нефтяных загрязнений окружающей среды //ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева),2001, т. ,5-6, с. 135 ). Исследованы параметры получения Саальгинатных гранул с иммобилизованными клетками нефтедеструктора,влияющих на характеристики биопрепаратов. (Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок Автореф. дисс. на соиск. уч. степени канд. тех. наук,Москва, 2007, с. 25). Известные биопрепараты получают в виде суспензий, эмульсий, паст, порошков. Жидкие и пастообразные препараты, в отличие от сухих форм,не требуют активации, однако срок хранения их при пониженной температуре, как правило, не превышает двух месяцев. 2 Создание высокоэффективных биопрепаратов для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов возможно лишь на основе активных углеводородокисляющих микроорганизмов и ассоциаций, адаптированных к условиям загрязнения, и разработки оригинальной технологии их производства с учетом физиологических особенностей штаммов. Известны штаммы нефтеокисляющих бактерий,выделенные из нефтезагрязненной почвы Атырауской области (Предварительные патенты РК 19848 Штамм бактерий 34, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2008, Оф. бюл.819843 Штамм бактерий 40, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2008. Оф. бюл.819842 Штамм бактерий 7-А, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2008, Оф. бюл. 819841 Штамм бактерий 65, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2008, Оф. бюл.819845 Штамм бактерий 41-3, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2008, Оф. бюл.8). Однако препараты на основе этих штаммов недостаточно эффективны, так как в них содержатся монокультуры бактерий. Наиболее близким техническим решением является биопрепарат на основе консорциума из штаммов 2 А и 41-3, выделенных из почв с хроническим нефтяным загрязнением. По результатам модельных экспериментов, он снижает концентрацию нефти при 5 загрязнении на 69,8,а при 10 загрязнении - на 64,4 за 3 месяца(Инновационный патент РК 22177 Консорциум штаммов 2 А и 41-3, используемый для очистки почв от нефти и нефтепродуктов, 2010,официальный Оф. бюл.1). Недостатком данного препарата является замедленный процесс утилизации нефти. Задачей изобретения является создание более эффективного биопрепарата для очистки почв от нефти и нефтепродуктов за счет высокой активности штаммов микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Это достигается тем, что препарат содержит ассоциацию бактериальных штаммов 40 и 34,7 А,адсорбированную на бентоните для повышения их активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды. Штаммы 34 и 40 представляют собой кокки, одиночные, в парах и в скоплениях, 1,25-2,0 мкм. Грамположительные,некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культуры образуют округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 1-2 мм. Край колоний ровный, пигменты в среду не выделяют. Аэробы. При росте в МПБ происходит помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется кольцевидная пленка. В качестве источника углерода используют глюкозу, лактозу, маннозу. Крахмал не гидролизуют, желатину не разжижают. Сероводород и индол не образуют. Нитраты восстанавливают до нитритов. Штамм 34 дает положительную реакцию на каталазу и оксидазу, а штамм 40 - положительную реакцию на катал азу и отрицательную на оксидазу. Выделены из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Характеризуются высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 34 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-67. Штамм бактерий 40 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-68. Штамм 7-А представляет собой кокки, прорастающие в палочки. Клетки неподвижные. Грамположительные,некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 2-3 мм. Край колоний ровный, пигменты в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ наблюдается помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется точечная пленка. В качестве источника углерода использует глюкозу,лактозу,маннозу с образованием кислоты. Крахмал не гидролизует,желатин не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию па каталазу и отрицательную на оксидазу. Выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 7-А депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК. Установлена наибольшая активность ассоциации при выращивании штаммов 7-А и 34 совместно, а штамма 40 - отдельно с последующим смешиванием в соотношении 21. Препарат готовят в пастообразном и сублимационно высушенном виде. В обеих препаратах бактерии адсорбированы на бентоните для повышения их активности и устойчивости к неблагоприятным факторам среды. В пастообразном препарате содержится не менее п.1012 КОЕ/мл, срок хранения не менее 3 месяцев, в сухом п.1012 КОЕ/мл, срок хранения 12 месяцев. По результатам испытаний на нефтезагрязненных почвах установлена высокая эффективность препарата. При внесении биопрепарата в нефтезагрязненные почвы процесс очистки повышается на 80 за минусом контроля(18). Признаки изобретения поясняются следующими конкретными примерами. Пример 1. Культуры микроорганизмов 40 и 34,7 А выращивают при различных соотношениях на питательной среде следующего состава, 431,0 К 2 НРО 4 - 1,0 КН 2 РО 4 -1,0 О 4- 0,2 СаС 12 0,02 3- 2 капли концентрированного раствора, -10,0 глюкоза - 1,0 питательный бульон-1,0 сырая нефть 0,1 вода - остальное, рН среды - 6,87,0. Жидкую питательную среду засевают упомянутыми исходными культурами микроорганизмов (каждую отдельно) в количестве 5 смывом с косяков МПА (х 108 КОЕ/мл) и культивируют на качалке в течение 1 суток при температуре 28 С. Полученный посевной материал индивидуальных штаммов засевают в различных соотношениях в ферментационную питательную среду того же состава и выращивают в аэробных условиях в течение 2 суток. После окончания ферментации культуры, выращенные отдельно,смешивают в равных соотношениях,при выращивании культур 7-А и 34 совместно,40 отдельно - в соотношении 21. Содержание бактерий в ассоциации определяют путем высева культур из соответствующих разведений на поверхность плотной питательной среды МПА. Нефтеокисляющую активность устанавливают гравиметрическим методом при росте ассоциации на среде ВД (Ворошилова-Дианова) с 2 нефти на качалке в течение 10 суток. При этом в отдельные варианты добавляют адсорбенты цеолит или бентонит. Результаты представлены в таблице 1. Установлено, что при совместном выращивании отобранных штаммов бактерий наблюдается более низкое накопление бактериальных клеток и слабая нефтеокисляюшая активность. Наибольшая активность выявлена при выращивании культур 7-А и 34 совместно,40 отдельно с последующим смешиванием их в соотношении 21. Установлено, что добавление в ассоциацию 2 цеолита или 3 бентонита значительно повышает ее нефтеокисляющую активность. Пример 2. Получение пастообразного препарата из отобранной ассоциации нефтеокисляющих бактерий. Выращивание ассоциации проводят аналогично примеру 1. Для осаждения биомассы в жидкую культуру добавляют 3 бентонита. Через 2-3,5 ч. биомассу биомассу, адсорбированную на бентоните,отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. Получают пастообразный 12 препарат с титром не менее 1,0 х 10 . Для определения нефтеокисляющей активности жидкие и пастообразных препараты засевают в количестве 10 в колбы Эрленмейера с питательной средой ВД, содержащей 2 нефти, а пастообразные 2 и 5 нефти, затем ставят на качалку на 10 суток. Установлено, что ассоциация в жидком виде утилизирует 50,5 нефти, а в пастообразном виде при содержании нефти в среде 5 -88,2 , при содержании 2 нефти - 94,2(таблица 2). 3 Пример 3. Получение сухого препарата. Выращивание ассоциации проводят аналогично примеру 1, а получение бактериальной пасты примеру 2. В бактериальную пасту добавляют 0,5 тиомочевины,разливают в специальные металлические лотки слоем не более 1,0 см. Лотки помещают в морозильную камеру и замораживают при температуре - 40-50 С в течение 6 часов. Высушивают в сублимационной сушилке КС-30. Температура досушивания продукта 25 С,разряжение 45 Па. Длительность сублимационного высушивания составляет 20-24 часа. Наибольшее количество жизнеспособных клеток выявлено в препаратах из индивидуальной культуры 1234 (1,610 ) и ассоциации 12(2,010 ) У препаратов установлена нефтеокисляющая активность в пределах 83-95(таблица 3). Пример 4. Испытание пастообразного порепарата, состоящего из культур 34,40,7. Препарат готовят аналогично примеру 2. Получено 20 кг пастообразного препарата с содержанием жизнеспособных клеток 3,61010 КОЕ/мл. Испытание препарата проводят на почве,загрязненной нефтью, с испытательного полигона ТОО. На испытательном полигоне площадью в 67,5 м 2 проводят выравнивание и планирование делянок. Участок схематически разделяют на 6 делянок по 11 м 2. Расстояние между делянками - 1 м. Для предотвращения вторичного загрязнения нефтезагрязненные почвы изолируют от подстилающего грунта высокопрочной пластиковой пленкой. На опытных делянках проводят агротехнические работы. Почву на каждой делянке подвергают трехкратному рыхлению с помощью культиватора Р 51016, рабочая глубина которого 150-300 мм. Затем на поверхность опытных делянок в 33 м 2 (исключая контроль) вносят органическое удобрение (навоз) в количестве 462 кг из расчета 14 кг на 1 м и минеральное удобрение (аммиачная селитра 4 О 3 производства Казфосфат, 2010 г.) из расчета 30 г на 1 м 2. Для определения содержания нефти в загрязненной почве после проведения агротехнических мероприятий и внесения органо-минерального удобрения отбирают пробы почв. Пастообразные препараты углеводородокисляющих микроорганизмов вносят в почву испытательного полигона дважды первично 10 кг биопрепарата разводят в 600 л воды, при повторном внесении - 5 кг. После внесения биопрепарата, почву увлажняют и тщательно культивируют. Через 1 месяц после обработки почвы биопрепаратом в ней определяют процент утилизации нефти. Определение содержания нефтепродуктов проводят по методике М 03-03-97 флуориметрическим методом на приборе Флюорат- 02. Данные таблицы 4 показывают,что естественный процесс самоочищения почвы от нефти при создании благоприятных условий привел к деструкции нефти на 18. В почвах, содержащих 18 нефти, после внесения биопрепарата процесс очистки повысился на 80 за минусом контроля. Противопоставляемый консорциум из штаммов 2 А и 41-3 в модельных экспериментах снизил за 3 месяца концентрацию нефти при 10 загрязнении на 64,4. Таким образом, по результатам испытания на нефтезагрязненных почвах можно говорить об эффективности предлагаемого препарата БАКОЙЛ- на основе ассоциации из культур 34,40,7 для биоремедиации почв от нефти и нефтепродуктов. Таблица 1 Нефтеокисляющая активность ассоциации в зависимости от способа ее приготовления Способ выращивания микроорганизмов Культуры микроорганизмов выращены совместно Культуры микроорганизмов выращены отдельно Наличие адсорбента при определении активности Нет Бентонит, 3 Каолин, 2 Таблица 2. Нефтеокисляющая активность жидких и пастообразных препаратов Вид препарата Таблица 3 Содержание жизнеспособных клеток бактерий в сублимационно высушенных препаратах Штаммы Нефтеокисляющая активность сухих препаратов,Таблица 4 Содержание нефти в почвах по вариантам опыта Варианты опыта Содержание нефти Процент После обработки в почве до содержания нефти в через 1 месяц, мг/кг обработки исходной почве препаратами, мг/кг Степень очистки почвы от нефти,ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Препарат для нефтепродуктов,нефтеокисляющие очистки почв от нефти и включающий аэробные бактерии и адсорбенты, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержит ассоциацию бактериальных штаммов 40 и 34,7 А, адсорбированную на бентоните.