Штамм A/equine/Kostanai/09/2012 (H3N8) М-7-12/D вируса гриппа лошадей, семейства Orthomyxoviridae рода Influenzavirus типа А подтипа H3N8, предназначенный для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа A/H3N8

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/145 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН/38,семействародатипа А подтипа 38,предназначенный для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа лошадей /38. Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гриппа лошадей /38, репродуцированный на 10 суточных куриных эмбрионах (КЭ) с биологической и гемагглютинирующей активностью 8,50 соответственно. Тесты на ЭИД 50/2 см 3 бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность штамма в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. Полученный штамм ///09/2012/38 депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) под регистрационным номером -7-12/ и хранится в нативном виде при минус 70 С в криопробирках. Жизнеспособность штамма в стабильном состоянии поддерживается путем освежения на 10-суточных КЭ каждые 2 года.(72) Орынбаев Мухит Бармакулы Сансызбай Абылай Рысбайулы Керимбаев Аслан Амангельдиевич Копеев Сырым Калдыбаевич Омарова Замира Даулетовна Калдыбаев Даулет Серикович Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Строчков Виталий Михайлович Бурашев Ербол Досанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(38) М-7-12/ ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ,СЕМЕЙСТВАРОДАТИПА А ПОДТИПА 38,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ГРИППА /38 Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гриппа/38, антигенно родственный вирусу гриппа лошадей, который может быть использован для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа лошадей /38. Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических,иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. Целью настоящего изобретения является получение нового казахстанского штамма вируса гриппа лошадей /38, антигенно родственного лошадиному вирусу гриппа и предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), иммуноферментном анализе(ИФА) для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания,определения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса /38 в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также приготовления вакцинных штаммов возбудителя. Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Республике Казахстан в результате вирусологических исследований в сентябре 2012 г. на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ) выделен вирус гриппа лошадей /38, антигенно родственный лошадиному, из носоглоточных смывов, отобранных от больной лошади конного завода ТОО Казак тулпары (Республика Казахстан, Костанайская область, г. Костанай). Штамм ///09/2012 (38) обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК вируса гриппа лошадей /38,подобного вирусу гриппа лошадей с помощью ОТПЦР, в конструировании рекомбинантных штаммов методом обратной генетики и разработке иммунобиологических препаратов(диагностических тест-систем, иммуноглобулина и вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений. В настоящем изобретении представлены антигенные,биологические и молекулярногенетические свойства этого вируса. Принадлежность выделенного штамма(38),антигенно родственного лошадиному вирусу гриппа, доказана методом ОТ-ПЦР в реальном времени,разработанной в для типирования и субтипирования вирусов гриппа /38. После заражения КЭ материалом от больной максимальное накопление гемагглютинирующего агента с гибелью эмбрионов отмечено через 72 ч. Инфекционная активность составила 8,50 ЭИД 50/2 см 3 (эмбриональная инфекционная доза). Число пассажей к моменту паспортизации - 3. Выделенный штамм ///09/2012(38) вируса гриппа лошадей /38 аналогов в 2 Республике Казахстан не имеет. Проведенный филогенетический анализ данного штамма подтверждает происхождение вируса гриппа лошадей от вируса, сходного с типичным представителем североамериканской линии свиного гриппа(12), являющимся тройным реассортантом классического свиного гриппа (1, , М и ),североамериканского гриппа птиц (РВ 2, РА) и человеческого гриппа 32 (РВ 1, 2). Известен штамм /-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа/11,репродуцируемый в культуре клетокпри температуре 37 С в течение 48-72 ч. Развитие цитопатического действия с полным разрушением монослоя отмечено через 72 ч. после инфицирования. При этом инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса через 48 ч. не превышает 6,50 ТЦД 50/см 3 (тканевая цитопатическая доза),5,50(агглютинирующие единицы) соответственно. Не вызывает гибели белых крыс в модельных опытах при подкожном,внутримышечном и внутрибрюшинном способе введения. Недостатками настоящего аналога штамма/-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11, репродуцируемый в культуре клетокболее низкая инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса не превышающая 6,50 ТЦД 50/см 3 (тканевая цитопатическая доза),5,50(агглютинирующие единицы) соответственно. Приведенный выше аналог является наиболее близким предлагаемому нами изобретению по совокупности существенных признаков и признан в качестве прототипа. Особенностями выделенного штамма///09/2012 (38) виуса гриппа лошадей /38 являются 1) различия по гену гемагглютинина от штамма/-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 2) изоляция вируса на КЭ против стандартной культуры клетокдля штамма //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 3) взаимодействие с эритроцитами человека и кур в более высоких титрах в реакции гемагглютинации (РГА), в отличие от штамма/- /01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11. Предлагаемое изобретение включает штамм,совокупность существенных признаков которого обеспечивает получение следующих технических результатов 1) высокая способность продуцироваться в КЭ выделен из аллантоисной полости 10-суточных КЭ через 48 ч. при 34 С после заражения. Изолированный вирус характеризовался титром 1128 ГАЕ. Инфекционный титр в КЭ через 72 ч. составил 8,50 ЭИД 50/2 см 3 2) контроль контаминации штамм не контаминирован микрофлорой,грибами,посторонними вирусами 3) способ хранения, в нативном виде. Эмбриональную вируссодержащую аллантоисную жидкость, разлитую в криопробирки замораживают при температуре минус 70 С. Чувствительность штамма к этиотропным лечебным препаратам Выявлена его резистентность к ремантадину(аминокислотная замена 31 в М 2 белке), высокая чувствительность к озельтамивиру (аминокислотная замена 275 в нейраминидазе не выявлена). Молекулярно-генетические свойства штамма Секвенирование полного генома вируса гриппа лошадей штамма ///09/2012 (38) выявило аминокислотные замены в вирионных белках М 2 и 1, отличающие данный штамм от штаммов пандемического вируса гриппа(11). В белке М 2 обнаружена аминокислотная замена 31, а в 1 белке аминокислотные замены 122 и 131 по сравнению со штаммами вируса гриппа(11). Аминокислотной замены 275 в последовательности гена нейраминидазы выявлено не было, однако обнаружена замена 248(11). По гену гемагглютинина наибольшее сходство выявлено со штаммом вируса гриппа///27004/2009 (11), выделенным от хорька, заболевшего от человека. Также у проанализированного штамма выявлено отсутствие аминокислотных замен в белке 2 по сравнению со штаммами вируса гриппа //05/2009(11) и //07/2009 (11). Все полученные последовательности генов были депонированы в Международную базу данных. С помощью международной базыопределен генотип нового штамма, который оказался смешанным и генетически отличным от человеческого сезонного вируса гриппа /11. Генотип казахстанского штамма вируса гриппа //07/2009/38 депонирован и хранится в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан с регистрационным номером -7-12/. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм ///09/2012 (38) вируса гриппа лошадей, семействародатипа А подтипа 38, депонирован и хранится в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций Республики Казахстан государственного предприятия Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под номером-7-12/,предназначенный для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа