Способ получения зигот животных на стадии двух пронуклеусов

(51) 6119/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа получения зигот на стадии двух пронуклеусов путем интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку. Способ получения зигот сельскохозяйственных животных на стадии двух пронуклеусов,включающий гормональную стимуляцию животных-доноров, датированное осеменение и вымывание зигот, яйцеклетки получают из фолликулов яичника забитых животных,культивируют, проводят интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида в яйцеклетку и через 14-16 часов получают зиготу с двумя пронуклеусами. 1 табл.(72) Батырханов Мархабат Серикбаевич Тореханов Айбын Адепханович Спанов Абзал Абушакипович Бакиров Нурбол Жумагадирович(56) Предварительный патент РК 3673, кл. А 6 19/00, 1996(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗИГОТ ЖИВОТНЫХ НА СТАДИИ ДВУХ ПРОНУКЛЕУСОВ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения трансгенных животных. 22008 Описание относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения трансгенных животных. Известен способ получения зигот животных на стадии двух пронуклеусов, включающий гормональную стимуляцию животных-доноров, датированное осеменение и вымывание зигот Предварительный патент Республики Казахстан 3673, кл. А 6119/04, 1996. Недостатком известного способа является низкий выход зигот на стадии двух пронуклеусов, а также временные затраты на гормональную стимуляцию и вымывание зигот. Задачей изобретения является получение и увеличение выхода зигот на стадии двух пронуклеусов. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа получения зигот на стадии двух пронуклеусов путем интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку. Способ получения зигот сельскохозяйственных животных на стадии двух пронуклеусов,включающий гормональную стимуляцию животных-доноров, датированное осеменение и вымывание зигот, яйцеклетки получают из фолликулов яичника забитых животных, культивируют, проводят интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида в яйцеклетку и через 14-16 часов получают зиготу с двумя пронуклеусами. Способ получения зигот животных на стадии двух пронуклеусов осуществляют следующим образом. Пример. Яичники, полученные с места убоя овцематок доставляют в лабораторию в пробирке со средой ДМЕМ с соблюдением температурного режима (37 С). В лаборатории путем аспирации фолликулов под ламинарным боксом яйцеклетки пипетором переносят в чистую среду. Полученные яйцеклетки оценивают по морфологическим критериям, соответствия стадии развития, правильности формы прозрачной оболочки, ее целостности, состояния цитоплазмы и прозрачности перивителлинового пространства. Яйцеклетки не достигшие стадии метафазыкультивируют в инкубаторе в среде-при температуре 37 С с 5 СО 2. Созревшая яйцеклетка характеризуется нали чием направительного тельца. Затем яйцеклетки с помощь капилляров диаметром 160-180 мкм в растворе гиалуронидазь очищают от фолликулярных клеток. Интрацитоплазматическую инъекцию спермия выполняют на микроманипуляционной системе, состоящей из микроскопа и высокоточных микроманипуляторов с использованием стерильных одноразовых стеклянных микроинструментов. Далее яйцеклетки помещают в предварительно подготовленные капли среды, а сперматозоиды в отдельную каплю с вязким раствором -, позволяющим проводить манипуляции со сперматозоидами. Капли сверху покрываются минеральным маслом, что позволяет поддерживать стабильные условия при проведении процедуры(поддержание температуры и стерильности). Перед введением сперматозоида его обездвиживают и помещают в полость микроиглы,затем переводят микроиглу в каплю с яйцеклеткой,затем с помощью присоски фиксируют яйцеклетку. После этого подводят микроиглу к капле с яйцеклеткой и производят введение иглы со сперматозоидом в цитоплазму, впрыскивают, после чего выводят микроиглу из яйцеклетки. После окончания процедуры яйцеклетки переносят в чашку для культивирования, каждую в отдельную каплю и помещают в инкубатор. Через 14-16 часов культивирования в инкубаторе яйцеклетки исследуют под микроскопом на наличие пронуклеусов. Результаты получения зигот сельскохозяйственных животных на стадии двух пронуклеусов указаны в таблице 1. Из данных таблицы видно, что из 14 яичников овец получено 224 фолликулярных ооцитов, после культивирования и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку отобрано 198 яйцеклеток, что составило 88,4. После интрацитоплазматической инъекции сперматозоида и,культивирования получено 150 морфологически полноценных зигот на стадии двух пронуклеусов или 75,8 от общего количества морфологически полноценных яйцеклеток Применение способа получения зигот сельскохозяйственных животных на стадии двух пронуклеусов позволит получать большое количество зигот на стадии двух пронуклеусов, точно определять время образования пронуклеусов, что необходимо для проведения работ по микроинъекции гена в пронуклеус. Таблица 1. Морфологическая оценка ооцитов и зигот на стадии двух пронуклеусов Показатели Общее Морфологически Дегенерированные количество полноценные ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения зигот сельскохозяйственных животных на стадии двух пронуклеусов,включающий гормональную стимуляцию животных доноров, датированное осеменение и вымывание зигот, отличающийся тем, что яйцеклетки получают из фолликулов яичника забитых животных, культивируют, проводят интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида в яйцеклетку и через 14-16 часов получают зиготу с двумя пронуклеусами.