Способ подготовки органов плода человека для получения клеточного материала

(51) 61 17/00 (2006.01) 12 5/08 (2006.01) 12 9/76 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ подготовки органов плода человека,включающий канюляцию инфраренального отдела брюшной аорты и надпеченочного отдела нижней полой вены, лигирования нижней полой вены в надпеченочном и инфраренальном отделах,лигирования аорты выше отхождения чревного ствола и над нижней брыжеечной артерией, а также лигирование верхней брыжеечной артерии. Через канюлированную аорту производится перфузия комплекса органовсо скоростью 15 мл/мин бескальциевым раствором Хенкса охлажденным до 4 С, а затем 0,05 раствором трипсина нагретым до 37 С. Перфузия бескальциевым раствором Хенкса позволяет отмыть органное русло от форменных элементов крови и способствует вымыванию из ткани ионов Са, приводя к частичному ослаблению межклеточных взаимодействий. Последующая перфузия 0,05 раствора трипсина разрушает элементы внеклеточного матрикса,также ослабляя межклеточные связи. Что позволяет применить минимальное механическое воздействие на этапе выделения клеток и повысить их жизнеспособность.(76) Доскалиев Жаксылык Акмурзаевич ,Григоревский Владимир Петрович , Аманбаев Серик Социалович , Джуманиязов Данияр Зауирович , Каюпов Болатбек Амангельдиевич(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОРГАНОВ ПЛОДА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА(57) Способ подготовки органов плода человека для получения клеточного материала. Изобретение относится к медицине, а именно трансплантологии, и может быть использовано для улучшения результатов выделения клеточного материала. 20474 Изобретение относится к медицине, а именно трансплантологии, и может быть использовано для улучшения результатов выделения клеточного материала. Известен способ подготовки печени для получения эмбриональных гепатоцитов человека включающий забор печени плода, канюлирование ее сосудов, отмывание ткани печени от форменных элементов солевым раствором Хенкса (патент РФ 2120752, кл.01 1/00, 12 5/00, 12 5/06,1998). Данный способ позволяет провести только отмывание ткани печени плода от форменных элементов и не влияет на процесс выделения клеточного материала. Использование для этой цели механической дезагрегации приводит к существенному повреждению клеток и снижению их жизнеспособности. Предварительное воздействие на ткань ферментами, разрушающими элементы внеклеточного матрикса или связывание(вымывание из ткани) ионов Са приводит к ослаблению межклеточных связей, что позволяет применить минимальное механическое воздействие для получения клеточного материала ( , .// ..-1969.-.43.-.506-520 Гринчишин В.П., Винарчук М.П., Осипова Л.А. Получение изолированных гепатоцитов и их оценка// Цитология и генетика. -1981. -Т. 15,2. -с.21-25). Кроме того, экспериментальная и клиническая трансплантология нуждается в последнее время в фетально-клеточном материале, полученном и из других органов, в частности из селезенки,поджелудочной железы и почек. Задачей изобретения является создание способ подготовки фетальной печени,селезенки,поджелудочной железы и почек человека для получения клеточного материала,который позволяет повысить выход жизнеспособных клеток. Способ подготовки органов плода человека,включающий канюляцию инфраренального отдела брюшной аорты и надпеченочного отдела нижней полой вены, лигирования нижней полой вены в надпеченочном и инфраренальном отделах,лигирования аорты выше отхождения чревного ствола и над нижней брыжеечной артерией, а также лигирование верхней брыжеечной артерии. Через канюлированную аорту производится перфузия комплекса органовсо скоростью 15 мл/мин бескальциевым раствором Хенкса охлажденным до 4 С, а затем 0,05 раствором трипсина нагретым до 37 С. Перфузия бескальциевым раствором Хенкса позволяет отмыть органное русло от форменных элементов крови и способствует вымыванию из ткани ионов Са, приводя к частичному ослаблению межклеточных взаимодействий. Последующая перфузия 0,05 раствора трипсина разрушает элементы внеклеточного матрикса,также ослабляя межклеточные связи. Что позволяет применить минимальное механическое воздействие на этапе выделения клеток и повысить их жизнеспособность. 2 Способ осуществляется следующим образом. После антисептической обработки плода человека (абортивный материал), в асептических условиях вскрывают переднюю брюшную стенку крестообразным разрезом, рассекают малый сальник, и как показано на фигуре, выделяют аорту 1 и лигируют(перевязывают) ее. В поддиафрагмальном отделе 2 (выше отхождения чревного ствола), а также перевязывают верхнюю брыжеечную артерию 3 (лигатура накладывается на корень брыжейки тонкой кишки). Затем рассекают брюшину по наружному краю нисходящей ободочной кишки, последнюю тупым путем отпрепаровывают медиально, обнажая брюшную аорту. Лигируют аорту выше отхождения нижней брыжеечной артерии 4 и канюлируют пластиковым катетером 5 над наложенной лигатурой. После чего нижнюю полую вену 6 лигируют в надпеченочном 7 и инфраренальном отделах 8 и производят канюляцию пластиковым катетером 9 в надпеченочном отделе ниже наложенной лигатуры 7. Катетер 5 установленный в инфраренальном отделе брюшной аорты соединяют с инфузоматом и начинают введение перфузионных растворов,достигающих по сосудам чревного ствола 10 и почечным артериям 11 комплекса органов (печень,селезенка, поджелудочная железа, почки). Отток перфузионных раствор происходит через катетер 9 установленный в надпеченочном отделе нижней полой вены. Начинают перфузию бескальциевым раствором Хенкса охлажденным до 4 С со скоростью 15 мл/мин в течение 8-10 мин, при этом необходимо ориентироваться на происходящее осветление поверхности печени, а оттекающий по канюле из надпеченочного отдела нижней полой вены раствор должен стать прозрачным. Затем перфузию проводят 0,05 раствором трипсина, нагретым до 37 С в течение 3 мин с прежней скоростью. После чего производят забор печени, селезенки,поджелудочной железы и почек и приступают к получению клеточного материала механическим способом. Таким образом, предложенный способ позволяет провести одновременное отмывание комплекса органов от форменных элементов крови, ослабляет силу межклеточных связей, улучшая тем самым результаты выделения клеточного материала. Перечень фигур чертежей и иных материалов Схема лигирования и канюлирования сосудов брюшной полости. Пример выполнения способа. Пример 1 -контрольная серия. Проведен забор печени, селезенки, поджелудочной железы и почек плода(абортивный материал,19 недель беременности). Вьшолнена канюляция сосудов печени, проведено отмывание ткани органа солевым раствором Хенкса. Перфузия остальных органов не проводилась вследствие невозможности канюляции их сосудов, имевших малый диаметр. С помощью гомогенизатора приготовлена суспензия клеток,разведена питательной средой 199 11, произведено суправитальное окрашивание суспензии 0,1 20474 раствором трипанового синего, в камере Горяева подсчитаны жизнеспособные клетки. Пример 2 -опытная серия. Проведена апробация способа подготовки органов плода (абортивный материал, 19 недель беременности) к получению клеточного материала. После выделения аорты,последняя лигирована в поддиафрагмальном отделе и выше отхождения нижней брыжеечной артерии,также перевязана верхняя брыжеечная артерия. Произведена канюляция инфраренального отдела аорты и надпеченочного сегмента нижней полой вены пластиковыми катетерами соответствующего диаметра. Нижняя полая вена лигирована ниже отхождения почечных вен. Через катетер в установленный в инфраренальном отделе брюшной аорты произведена перфузия комплекса органов(печень, селезенку, поджелудочную железу, тонкий и толстый кишечник, почки с надпочечниками) бескальциевым раствором Хенкса охлажденным до 4 С со скоростью 15 мл/мин в течение 8 мин. Затем в течение 3 мин с прежней скоростью, перфузировали 0,05 раствор трипсина, нагретым до 37 С. После чего производен забор печени,селезенки, поджелудочной железы и почек, с помощью гомогенизатора получен клеточный материал. Жизнеспособные клетки подсчитаны в камере Горяева. По сравнению с контрольной серией из каждого органа было получено в среднем на 18 больше жизнеспособных клеток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ подготовки органов плода человека для получения клеточного материала, включающий канюлирование сосудов,перфузию органов раствором Хенкса и забор органов плода,отличающийся тем, что перфузию органов проводят бескальциевым раствором Хенкса,охлажденным до 4 С, со скоростью 15 мл/мин, в течение 8-10 минут, после чего проводят перфузию органов 0,05 раствором трипсина, нагретым до 37 С, со скоростью 15 мл/мин, в течение 3 минут.