Штамм “VRC-RZ2″ вируса-фикс бешенства для приготовления профилактических и диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) 12 1/93 (2006.01) 61 39/205 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ -2 ВИРУСА-ФИКС БЕШЕНСТВА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относиться к ветеринарной вирусологии. Полученный штамм -2 вируса-фикс бешенства характеризуется высокими репродуктивными свойствами в системе культивирования и высокой биологической активностью. Штамм -2 вируса-фикс бешенства для приготовления диагностических (РДП, МФА, ИФА,РСК) и профилактических (парентеральной и пероральной вакцины против бешенства животных) препаратов.(72) Русанова Анастасия Михайловна Жилин Евгений Сергеевич Троицкий Евгений Николаевич Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Баракбаев Кайнар Базаркулович Демченко Анатолий Григорьевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 17453 Изобретение относиться к ветеринарной вирусологии. Штамм Щелково-51 - используется для приготовления вакцин антирабических инактивированных,культуральных Рабиков,Рабикан (коммерческие названия вакцин). Предприятие изготовитель - ФГУ ВНИИЗЖ (Бешенство животных Груздев К.Н., Недосеков В.В. Москва,изд-во Аквариум, 2001 г.). Штамм ТС-80 - используется приготовления вакцины антирабической,инактивированной,культуральной,сорбированной. Предприятие изготовитель ВНИИВВМиМ.(Бешенство животных Груздев К.Н., Недосеков В.В. Москва,изд-во Аквариум, 2001 г.). Штамм Внуково-32 - используется приготовления вакцины антирабической, инактивированной,концентрированной, культуральной. Предприятие изготовитель -Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Чумакова РАМН. (Бешенство животных Груздев К.Н., Недосеков В.В. Москва,изд-во Аквариум, 2001 г.). Штамм РВ-97 - используется приготовления вакцины антирабической,инактивированной,культуральной,сорбированной. Предприятие изготовитель - ФГУ ВНИИЗЖ. (Бешенство животных Груздев К.Н., Недосеков В.В. Москва,изд-во Аквариум, 2001 г.). Все вышеописанные штаммы вируса-фикс бешенства культивируются в перевиваемых культурах клеток, имеют титр вируса не менее 6,00 М 50/мл, иммуногенность вакцин напрямую зависит от титра вируса. Все вышеописанные вакцины зарегистрированы в Государственном Реестре Российской Федерации. Недостатки этих штаммов в цитируемой литературе не указываются, но в данном случае это не важно,поскольку, как уже было указано выше, в Республике Казахстан в настоящее время отсутствуют штаммы вируса-фикс бешенства,поддерживаемые на перевиваемых культурах клеток и используемые для приготовления профилактических и диагностических препаратов. Задачей изобретения является создание культурального штамма вируса бешенства животных, обладающего высокой биологической и иммуногенной активностью, низкой вирулентностью и хорошей репродуктивной способностью в системе культивирования. Штамм -2 выделен из тканевого(мозгового) изолята вируса бешенства и адаптирован к репродукции в перевиваемой культуре клеток почек сайги путем последовательных и перемежающих пассажей на мышатах сосунах и культурах клеток ВНК-21/13 и ПС. Полученный штамм вируса обличается от исходного изолята органно-тканевого рабического вируса системой культивирования,низкой вирулентностью при внутримышечном,внутрикожном и подкожном введение, биологической активностью. При этом в культуре клеток ПС накопление вируса происходит до 6,0 ТЦД 50/см 3. 2 Выделенный штамм -2 депонирован в Коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского сельскохозяйственного института Министерства образования и науки Республики Казахстан с регистрационным номером П-7-04/Д. Штамм -2 вируса-фикс бешенства активно репродуцируется в перевиваемой культуре клеток ПС при температуре (37,00,5)С. При этом биологическая активность вируса достигает при стационарном культивировании до 5,5 ТЦД 50/см 3, при роллерном культивировании до 6,0 ТЦД 50/см 3. Выделенный штамм -2 характеризуется следующими свойствами. Условия культивирования Штамм -2 вируса-фикс бешенства активно репродуцируется в перевиваемой культуре клеток ПС при температуре(37,00,5)С, заражающей дозе 0,005-0,01 ТЦД 50 на клетку. В качестве питательной среды используется пристеночная полусинтетическая среда (ПСП), рН 7,4-7,8 2 инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 57 суток. Культивирование проводится как стационарным, так и роллерным методом. Активности штамма При соблюдении условий культивирования биологическая активность вируса достигает при стационарном культивировании до 5,5 ТЦД 50/см 3, при роллерном культивировании до 60 ТЦД 50/см 3. Способ определения активности вируса Активность вируса определяется 2-мя способами По цитопатическим изменениям в культуре клеток ПС (почка сайги). Делаются 10-кратные разведения вируса, каждым разведением вируса инфицируется по 4-е пробирки с культурой клеток. Цитопатическое действие вируса учитывают ежедневно под малым увеличением микроскопа. Титр вируса рассчитывается по методу Рида и Менча и выражается вТЦД 50/см 3. Заражение мышей. Делаются 10-кратные разведения вируса. Каждым разведением вируса интрацеребрально инфицируется по 4 мыши. Положительный результат мышь пала,отрицательный выжила. Титр вируса рассчитывается по методу Рида и Менча и выражается в 50/см 3. Во втором пункте запроса экспертами отмечено,что в описании к заявке 2004/1775.1 предложенный нами штамм может использоваться,как контрольный штамм при испытании вакцинных препаратов. Таких данных мы не приводили в описании. Безвредность Полностью безвреден для овец,собак, кроликов при подкожном, внутрикожном,внутримышечном введении, (эти данные без указания вида животных представлены в описании) Активность(иммуногенность) Собаки,получившие однократную внутримышечную инъекцию в объеме 1 см 3 (активностью 4,5 50/см 3),через 14 суток противостоят интрацеребральному контрольному заражению. Контрольные животные (не вакцинированные животные) при интрацеребральном контрольном 17453 заражении погибают на 5-7 сутки с клиническими признаками присущими бешенству. Для антигена термин оптимальная концентрация вирусных клеток не применим. Качество (специфичность) и активность антигена оценивают в серологических реакциях. Специфичность культурального антигена предлагаемого штамма подтверждена в реакции диффузионной преципитации с коммерческим набором Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий (ИДАП) для диагностики бешенства методом реакции диффузионной преципитации(РДП) НПО АНТИГЕН ТУ 640 РК 17286-1910-002-2001 и в реакции иммунофлуоресценции с коммерческими наборами Иммуноглобулин диагностический антирабический флуоресцирующий (ИДАФ) для диагностики бешенства прямым методом иммунофлуоресцентной микроскопии (ПМИМ) ТОО АНТИГЕН ТУ 640 РК 17286-1910-001-2001,Антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин (ИДАФ) для диагностики бешенства прямым методом РИФ (реакция иммунофлуоресценции) ТОО Вита-СТ ТУ 658 РК 620200013526 ТОО 0242001 В мазках-отпечатках, приготовленных из суспензии и монослойной культуры клеток ПС и обработанных меченными ФИТЦ глобулинами из наборов Иммуноглобулин диагностический антирабический флуоресцирующий (ИДАФ) для диагностики бешенства прямым методом иммунофлуоресцентной микроскопии (ПМИМ),Антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин (ИДАФ) для диагностики бешенства прямым методом РИФ (реакция иммунофлуоресценции),обнаружено специфическое свечение гранул на четыре креста, что говорит о высоком накоплении антигена вируса бешенства. Титр антигена предлагаемого штамма определялся в реакции диффузионной преципитации с коммерческим набором Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий (ИДАП) для диагностики бешенства методом реакции диффузионной преципитации (РДП) НПО АНТИГЕН и составил 12-14. Специфическая активность сывороток крови коз,полученных на введение антигена предлагаемого штамма, оценена в реакции диффузионной преципитации с положительным контрольным антигеном (бешенства) из коммерческого набора Иммуноглобулин диагностический антирабический преципитирующий (ИДАП) для диагностики бешенства методом реакции диффузионной преципитации (РДП) НПО АНТИГЕН и составляет 116-132. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм -2 вируса-фикс бешенства(НИСХИ, П-7-04/Д) для приготовления профилактических и диагностических препаратов.