Фрагмент ДНК (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий

(51)6 12 15/53, 15/82, 9/02, 12 7/64 НАЦИОНАЛЬНОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ФРАГМЕНТ ДНК (ВАРИАНТЫ), ВЕКТОР,СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЯ, СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИИ ГАММАЛИНОЛЕНОВОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ),СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИИ ОКТАДЕКАТЕТРАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ И ДЕЛЬТА-6-ДЕСАТУРАЗА ЦИАНОБАКТЕРИЙ(57) Предложены фермент 6-десатураза, конвертирующий линолевую кислоту в -линоленовую кислоту, и кодирующая ДНК - последовательность. Изобретение также относится к способам получения растений с повышенным содержанием гаммалиноленовой кислоты и растений, устойчивых к низким температурам, предусматривающим трансформацию растений указанной ДНК. 9577 Линолевая кислота (182) (А) может быть превращена в -линоленовую кислоту (183) (А) посредством фермента 6-десатуразы. Если этот фермент или нуклеиновую кислоту, кодирующую этот фермент, перенести в -продуцирующие клетки, то будет продуцироваться . Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей ген 6-десатуразы. В частности, указанная нуклеиновая кислота включает в себя промотор, кодирующую область и область терминации гена 6 десатуразы. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным конструкциям, содержащим область, кодирующую 6-десатуразу, в функциональной комбинации с гетерологическими регуляторными последовательностями. Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции настоящего изобретения могут быть использованы для продуцированияв трансгенных организмах. Ненасыщенные жирные кислоты, такие, как линолевая кислота (С 189,12) и -линоленовая кислота(С 189,12,15), представляют собой незаменимые составные компоненты пищи и не могут быть синтезированы позвоночными, поскольку клетки позвоночных могут вводить двойные связи в 9-положение жирных кислот, но, при этом, они не могут вводить дополнительные двойные связи между двойной связью 9 и метиловым концом цепи жирной кислоты. Поскольку линолевая и -линоленовая кислоты являются предшественниками других продуктов, то эти кислоты относят к незаменимым жирным кислотам, которые обычно получают из растительных источников. В организме млекопитающего линолевая кислота превращается в -линоленовую кислоту(, 186,9,17), которая, в свою очередь, может быть превращена в арахидоновую кислоту (204),играющую особо важную роль в организме млекопитающего, поскольку она является главным предшественником большинства простагландинов. Продукты питания, в состав которых входит линолевая кислота, обычно удовлетворяют потребность организма в А и арахидоновой кислоте,поскольку А и арахидоновая кислота являются метаболитами линолевой кислоты. Однако было установлено, что имеется определенная зависимость между потреблением насыщенных жиров и повышенным риском для здоровья, связанным с такими нарушениями в организме, как гиперхолестеринемия, атеросклероз, и другие расстройства химического баланса организма, которые коррелируют с его восприимчивостью к ишемической болезни сердца тогда как потребление ненасыщенных жиров ассоциируется с понижением концентрации холестерина в крови и со снижением риска заболевания атеросклерозом. Положительный терапевтический эффект, связанный с присутствием А в пище, очевидно, обусловлен тем, что А, будучи предшественником арахидоновой кислоты, вносит свой вклад в синтез простагландина. В соответствии с этим,употребление в пищу большего количества ненасыщенной А, вместо линолевой кислоты, оказывает 2 благоприятное воздействие на здоровье организма. Однако, фактически, ни в одной из возделываемых сельскохозяйственных культур А не присутствует. В организме линолевая кислота превращается в А с помощью фермента 6-десатуразы. 6 Десатураза, которая представляет собой фермент,состоящий примерно из 359 аминокислот, имеет связанную с мембраной область и активный сайт десатурации жирных кислот. При перенесении указанного фермента в клетки, эндогенно продуцирующие линолевую кислоту, но не продуцирующие А, эти клетки приобретают способность продуцировать А. В соответствии с настоящим изобретением, выделение гена, кодирующего 6 десатуразу, дает возможность получить трансгенные организмы, которые содержат функциональную 6 десатуразу и обладают способностью продуцировать А. Кроме того, настоящее изобретение, позволяющее продуцировать большие количества А,открывает новые возможности для получения ценных пищевых продуктов, являющихся источниками А. Настоящее изобретение относится к выделенному гену 6-десатуразы. В частности, указанный выделенный ген включает в себя промоторную область 6-десатуразы, ее кодирующую область и область терминации. Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим промотор,кодирующую область и область терминации 6 десатуразы. Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим кодирующую область 6-десатуразы в функциональной комбинации с гетерологическими регуляторными областями, то есть, элементами, не происходящими от гена 6-десатуразы. Настоящее изобретение также относится к клеткам и организмам, содержащим векторы настоящего изобретения, и к потомству указанных организмов. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенной бактериальной 6-десатуразе, а также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей бактериальную 6-десатуразу. Настоящее изобретение также относится к способу получения растений с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты (А), предусматривающему трансформацию клетки растения с помощью выделенной нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и регенерацию растения с повышенным содержанием А из указанной клетки растения. Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования растений, обладающих устойчивостью к низким температурам. На фиг. 1 представлены профили гидрофобности и гидрофильности выведенных аминокислотных последовательностей 6-десатуразы 9577 Предполагаемые мембранные области показаны сплошными отрезками. Показатель гидрофобности вычисляли для фрагмента из 19 аминокислотных остатков ( и др., 1982, . . , 157). На фиг. 2 представлены профили газожидкостной хроматографиидикого типа (фиг. 2 А) и трансгенной(фиг. 2 В). На фиг. 3 схематически представлены карты космид с 75,13 и с 7 с перекрывающимися областями и субклонами. Происхождение субклонов с 75,75-3,5 и с 7 показаны диагональными пунктирными линиями. Сайты рестрикции, которые были инактивированы, указаны в скобках. На фиг. 4 представлены профили газожидкостной хроматографии, относящиеся к растению табака дикого типа (фиг. 4 А) и трансгенному растению табака (фиг. 4 В). Настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей 6-десатуразу. Для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей 6-десатуразу, из организма, который продуцирует , выделяли ДНК. Таким организмом может быть, например, клетка животного, некоторые грибки (такие, как ), некоторые бактерии (такие, как ), либо некоторые растения (бурачник, ослинник , смородина). Выделение геномной ДНК может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистам и описанными, например, Сэмбруком и др. (1989) в.,, . Выделенную ДНК подвергали фрагментации с использованием физических методов, или путем ферментного переваривания, и клонировали в соответствующий вектор, например, фазовый или космидный вектор,с помощью любого из хорошо известных способов,описанных, например, Сэмбруком и др. (1989). В настоящей заявке рассматриваются векторы экспрессии, содержащие ДНК настоящего изобретения. ДНК, кодирующая 6-десатуразу, может быть идентифицирована посредством функционального анализа. Вектор, содержащий фрагментированную ДНК,переносят например, путем инфекции, трансконъюгирования, трансфекции, в организм хозяина, который продуцирует линолевую кислоту, но не гаммалиноленовую кислоту . Используемый в настоящем описании термин трансформация означает, в основном, введение чужеродной ДНК в клеткухозяина. Введение рекомбинантной ДНК в организм хозяина может быть осуществлено любым из хорошо известных традиционных методов, описание которых приводится, например, в работе Сэмбрука и др. (1989). Продуцированиеуказанными организмами (т. е. приобретение ими этой функции) оценивают с помощью газовой хроматографии или другими традиционными методами, хорошо известными специалистам. Организмы, наделенные способностью продуцировать , т. е. обладающие этой функцией благодаря введению им вышеуказанного вектора, идентифицируют как организмы, экс прессирующие ДНК, которая кодирует 6 десатуразу и после такой идентификации указанную ДНК выделяют из этих организмов. Выделенная ДНК может быть снова подвергнута фрагментации,клонированию в векторы экспрессии, и функциональной оценке с использованием вышеуказанных процедур в целях более конкретной характеризации ДНК, кодирующей 6-десатуразу. В качестве иллюстрации настоящего изобретения могут служить следующие процедуры случайную ДНК выделяют из цианобактерииПастеровская коллекция культур (РС) 6803, Американская коллекция типовых культур (АТСС) 27184 клоинируют в космидный вектор и путем трансконъюгирования вводят в штамм РСС 7120,АТСС 27893 цианобактерии . Продуцированиеиз линолевой кислотыконтролируют с помощью газовой хроматографии, а соответствующий ДНК-фрагмент выделяют. Выделенную ДНК секвенируют стандартными способами, хорошо известными специалистам, и описанными, например, Сэмбруком и др. (1989). В соответствии с настоящим изобретением, была выделена ДНК, содержащая ген 6-десатуразы. Более конкретно, из цианобактериибыло выделено 3,588 тыс. пар оснований (к) ДНК, содержащей ген 6-десатуразы. Была определена нуклеотидная последовательность указанной 3,588 кДНК, представленная в 1. Открытые рамки считывания, определяющие потенциальные кодирующие области, находятся на участке от нуклеотида 317 до нуклеотида 1507 и от нуклеотида 2002 до нуклеотида 3081. Для идентификации нуклеотидов,ответственных за кодирование 6-десатуразы, 3,588 к-фрагмент, несущий 6-десатуразную активность,расщепляли на два субфрагмента, каждый из которых содержал лишь одну открытую рамку считывания. Фрагмент 1 содержал нуклеотиды 1-1704, а фрагмент 2 содержал нуклеотиды 1705-3588. Каждый фрагмент субклонировали как в прямой,так и в обратной ориентации в конъюгированный вектор экспрессии (АМ 542,и др., 1984 .. . .81, 1581), который содержал промотор карбоксилазы цианобактерии. Полученные конструкции (т. е. 1, 1, 2 и О 2( конъюгировали в штамм дикого типа РСС 7120 стандартными методами (см., например,и др. (1984) . . . .81, 1561). Конъюгированные клеткиидентифицировали как зеленые колониина коричневом фоне погибших неконъюгированных клеток через две недели после их культивирования на селективных средах (стандартная минеральная среда 1130 мкг/мл неомицина, согласнои др.,(1979) . . . 111, 1). Эти зеленые колонии отбирали и культивировали на жидкой среде 9577 техники (например,и др. (1989)С 66, 543). Для сравнения, липиды также экстрагировали из культуридикого типа. Метиловые сложные эфиры жирной кислоты анализировали с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), используя, например, газожидкостный хроматограф Т-560, снабженный пламенно-ионизационным детектором (где источником ионизации является водородное пламя), и капиллярной колонкой. Результаты ГЖХ-анализа приводятся в табл. 1. Таблица 1 Присутствие жирных кислот (С 18) в цианобактериях дикого типа и трансгенных цианобактериях Источник(дикого типа) 1 1 2 2(дикого типа) Как показал ГЖХ-анализ, , не продуцирующая , приобретает способность к продуцированию после введения в нее конструкции,содержащей 2 в прямой ориентации, посредством трансконъюгирования. Трансконъюганты, содержащие конструкции с 2 в обратной ориентации по отношению к промотору карбоксилазы, и конструкции с 1 в обеих ориентациях, не обнаруживали продуцирования . Это свидетельствует о том, что лишь одна открытая рамка считывания(2), находящаяся в 1884 п.о. - фрагмента, кодирует 6-десатуразу. Этот 1884 п.о. - фрагмент показан на 3. Этот факт полностью подтверждается идентичностью профилей гидрофильности и гидрофобности между 6-десатуразой и 12 десатуразой ( и др., 1990,347), как показано на фиг. 1 А и 1 В, соответственно. Выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие 6-десатуразу, могут быть идентифицированы из других -продуцирующих организмов с помощью функциональных анализов, описанных выше,либо с помощью техники гибридизации нуклеиновой кислоты, где в качестве гибридизационного зонда используется выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует 6-десатуразу . Методы клонирования кДНК и геномной ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы в целях настоящего изобретения. Гибридизационный зонд может содержать полную ДНК-последовательность, представленную в 1 либо ее рестрикционный фрагмент, либо какой-нибудь другой фрагмент ДНК, например, олигонуклеотидный зонд. Методы клонирования гомологичных генов посредством перекрестной гибридизации известны каждому специалисту и описаны, например, (1989) ии др. (1983)100, 266. Трансгенные организмы, наделенные способностью к -продуцированию путем введения им ДНК, кодирующей 6-десатуразу,приобретают также способность продуцировать октадекатетраеновую кислоту (1846,9,12,15). Обычно октадекатетраеновая кислота присутствует в рыбьем жире и в 4 некоторых видах растений семейства(. 1874 . .С. . 41, 209211., 1976 . .56, 659-664). В трансгенных организмах настоящего изобретения,октадекатетраеновая кислота образуется в результате последующей десатурации -линоленовой кислоты, опосредованной 6-десатуразой, либо десатурации , опосредованной 15-десатуразой. На 2 показаны 359 аминокислот, кодируемых открытой рамкой считывания 2, т. е. открытой рамкой считывания, кодирующей 6 десатуразу. В рамках настоящего изобретения также рассматриваются и другие олигонуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислоты в 2. Идентификация последовательностей,которые, например, являются результатом вырожденности генетического кода, может быть осуществлена любым специалистом. Кроме того, с помощью функционального анализа, описанного выше, любой специалист может определить более мелкие субфрагменты из 1884 п.о. - фрагмента, содержащего 2, которая кодирует 6-десатуразу. В настоящем описании рассматриваются любой из указанных полипептидных фрагментов 6 десатуразы и нуклеиновые кислоты, которые сохраняют способность к превращениюв . В другом варианте осуществления настоящего изобретения, вектор, включающий в себя либо 1884 п.о.-фрагмент, либо более мелкий фрагмент, содержащий промотор, кодирующую последовательность и область терминации гена 6-десатуразы, переносят в организм, например, цианобактерию, где промотор и область терминации 6-десатуразы являются функциональными. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к организмам, продуцирующим рекомбинантную 6-десатуразу. В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к выделенной 6-десатуразе,которая может быть очищена из рекомбинантных организмов стандартными методами, обычно используемыми для очистки белков (см., например, и др., 1987 9577 Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим ДНК, которые кодируют 6 десатуразу. Каждому специалисту ясно, что могут быть сконструированы соответствующие векторы для непосредственной экспрессии последовательности, кодирующей 6-десатуразу, в ряде организмов. Особенно предпочтительными являются реплицируемые векторы экспрессии. Реплицируемые векторы экспрессии, описываемые в настоящей заявке,представляют собой ДНК- или РНК-молекулы, сконструированные для регулируемой экспрессии нужного гена, т. е. гена 6-десатуразы. Предпочтительными векторами являются плазмиды, бактериофаги,космиды или вирусы. В соответствии с настоящим изобретением, могут быть также использованы челночные векторы, описанныеи др. (1984) .. . . , 1561-1565 ии др.,(1991) .174, 7525-7533. Детальный обзор векторов, в которые может быть введена и экспрессирована нуклеиновая кислота, кодирующая 6 десатуразу настоящего изобретения, приводится в работах(1989), , . (1990)185,(1988),, . Указанные векторы также содержат нуклеиновокислотные последовательности,которые могут осуществлять экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих 6-десатуразу. Элементами последовательности, способными осуществлять экспрессию генного продукта, являются промоторы,элементы энхансера, расположенные выше по течению активирующие последовательности, сигналы терминации транскрипции, и сайты полиаденилирования. При этом могут быть использованы как конститутивный (т. е. нерегулируемый), так и тканеспецифический промоторы. В отношении трансформации растительных клеток, особый интерес представляют промотор 35 вируса мозаики цветной капусты (Са) и промоторы, регулируемые в процессе созревания семян растения. Все указанные промоторы и элементы, регулирующие транскрипцию, взятые отдельно или в сочетании друг с другом, могут быть использованы в реплицируемых векторах экспрессии настоящего изобретения, и хорошо известны специалистам. Например, промотор 35 описани др. (1990) ( , 2, 987). В настоящем описании также рассматриваются генетически сконструированные и мутированные регуляторные последовательности. Выбор векторов и регуляторных элементов, подходящих для экспрессии в конкретных клеткаххозяевах, может быть осуществлен любым специалистом. Например, для экспрессии 6-десатуразы в цианобактерии, подходящим является вектор, содержащий промотор от гена, кодирующего карбоксилазу , и правильно присоединенный к области, кодирующей 6-десатуразу, а также правильно присоединенный к сигналу терминации, происходящему от . Термин правильно присоединенный в контексте настоящего описания означает, что присоединенные промоторные и терминаторные последовательности эффективно осуществляют свои функции регуляции транскрипции. Еще одним примером вектора, подходящего для экспрессии 6-десатуразы в трансгенных растениях,может служить вектор, содержащий семяспецифический промотор, происходящий от гена гелиантинина, напина, или глицина, и правильно присоединенный к области, кодирующий 6-десатуразу, а также к области сигнала терминации, происходящего из семян, или сигнала терминации нопалин-синтазы. В частности, регуляторные элементы гелиантинина раскрываются в одновременно рассматриваемой заявке на патент США г.682354 (поданной 8 апреля 1991, и вводимой в настоящее описание посредством ссылки), где они рассматриваются как промоторные элементы, под контролем которых осуществляется экспрессия 6-десатуразы настоящего изобретения. Однако модификации нуклеотидных последовательностей и регуляторных элементов, раскрываемых в настоящей заявке, и сохраняющих свои основные функции, не выходят за рамки объема настоящего изобретения. Такими модификациями являются инсерции, замещения и делеции, а предпочтительно замещения, которые отражают вырожденность генетического кода. Стандартная техника конструирования таких гибридных векторов хорошо известна каждому специалисту и описана в работах Сэмбрука и др. (1989),либо в любом из многочисленных пособий по лабораторным исследованиям, относящихся к технике рекомбинантных ДНК. Для осуществления лигирования фрагментов ДНК также имеется ряд стандартных методик, выбор которых зависит от природы концов ДНК-фрагментов. Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает введение в гибридные векторы других элементов нуклеотидной последовательности, которые облегчают клонирование, экспрессию или процессинг, например, последовательности, кодирующие сигнальные пептиды последовательность, кодирующая , и необходимая для удерживания белков в эндоплазматическом ретикулуме или последовательности, кодирующие транзитные пептиды, которые направляют 6-десатуразу в хлоропласт. Все указанные последовательности хорошо известны каждому специалисту. Оптимизированный транзитный пептид описан, например,и др., (1985)313,358. Прокариотические и эукариотические сигнальные последовательности раскрываются, например, и др. (1982), . . . 36, 425. В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к организмам, которые не являются цианобактериями, и которые содержат ДНК, кодирующую 6-десатуразу настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, трансгенными организмами могут быть бактерии, цианобактерии, грибки, растения и животные. Выделенная ДНК настоящего изобретения 5 9577 может быть введена в организм хозяина любыми стандартными методами, например, путем инфицирования, трансфекции, трансформации или трансконъюгирования. Техника перенесения ДНК настоящего изобретения в указанные организмы хорошо известна специалистам и описана в литературе, например, Сэмбруком и др. (1989). Существуют различные методы трансформации растений, хорошо известные специалистам. Ген 6 десатуразы может быть введен в растения с использованием процедуры трансформации дисков листьев с последующей регенерацией растения из этих листьев, которая описана Н и др. (1985)227, 1229. В настоящем изобретении могут быть также использованы и другие методы трансформации, такие, как культивирование протопластов((1984)223, 496.,(1984). 2, 2143. (1983)32,1033). В предпочтительном варианте настоящего изобретения, растения могут быть трансформированы с помощью векторов, происходящих от. Однако для введения гена 6 десатуразы настоящего изобретения в растительные клетки могут быть использованы и другие методы. Такими альтернативными методами могут быть биологические методы ( и др. (1987)327, 70), электропорация, химически индуцированное внедрение ДНК, а также использование вирусов или пыльцы в качестве векторов. В методе трансформации, если это необходимо,ген 6-десатуразы настоящего изобретения может быть введен в растение-трансформирущий вектор,например, в бинарный вектор, описанный(1984) с 12, 8111. Растениетрансформирующие векторы могут быть получены путем модификации натуральной системы переноса гена, происходящей от. Указанная натуральная система включает в себя крупные(опухоль-индуцирующие)-плазмиды,содержащие крупный сегмент, известный как ТДНК, который переносят в трансформируемое растение. Другой сегмент Т-плазмиды, а именно область, является ответственным за перенос Т-ДНК. По краям указанной Т-ДНК-области находятся концевые повторы. В модифицированных бинарных векторах опухоль-индуцирующие гены были делетированы, а функции -области были использованы для переноса чужеродной ДНК, окаймленной концевыми последовательностями Т-ДНК. Т-область также содержит маркер, селектируемый на резистентность к антибиотику, и сайт многократного клонирования для инсерции последовательностей, предназначенных для переноса. Сконструированные таким образом штаммы известны как обезвреженные штаммы . , и используются для эффективной трансформации последовательностей, фланкированных Т-областью, в нуклеарные геномы растений. Диски листьев со стерилизованной поверхностью инокулируют штаммом . , содержащим 6 обезвреженную чужеродную ДНК культивируют два дня, а затем переносят в среду, содержащую антибиотик. Трансформированные проростки отбирают после образования корней в среде, содержащей соответствующий антибиотик, переносят в почву и регенерируют.другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям или их потомству, содержащим выделенную ДНК настоящего изобретения. В целях настоящего изобретения могут быть использованы как однодольные растения, так и двудольные растения. Растительные клетки трансформируют посредством выделенной ДНК, кодирующей 6-десатуразу, с использованием любого из описанных выше методов трансформации растения. Трансформированные растительные клетки, обычно, в каллюсной культуре или диске листьев, регенерируют в цельное трансгенное растение традиционными методами, хорошо известными специалистам (например, с и др.,1985. , 227, 1129). В предпочтительном варианте настоящего изобретения, трансгенным растением является подсолнечник, масличный рапс, кукуруза (маис), табак, арахис или соя. Поскольку потомство трансформированных растений наследует ДНК,кодирующую 6-десатуразу, то для сохранения линии трансгенного растения используются семена или черенки. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения трансгенных растенийповышенным содержанием . Этот способ предусматривает введение ДНК, кодирующей 6-десатуразу, в клетки растений, содержащие низкие уровниили вообще не содержащие , но при этом содержащиеи регенерацию растений с повышенным содержаниемиз трансгенных клеток. В частности, в качестве трансгенных организмов могут быть использованы коммерчески культивированные культурные растения, примерами которых, не ограничивающими, однако, объема изобретения,являются подсолнечник, соя, масличный рапс, маис,арахис и табак. Настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенных организмов, содержащих. Этот способ предусматривает введение ДНК,кодирующей 6-дезатуразу, в организм, который содержит очень низкие уровниили вовсе не содержит , но содержит А. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, этот способ предусматривает введение одного или нескольких векторов экспрессии, которые содержат ДНК, кодирующую 12-десатуразу и 6-десатуразу, в организмы с недостаточностьюи А. В соответствии с этим, в организмах с недостаточным содержанием А истимулируют продуцирование А посредством экспрессии 12-десатуразы, а затем генерируютпосредством экспрессии 6 десатуразы. Векторы экспрессии, содержащие ДНК,которая кодирует 12-десатуразу, или 12 десатуразу и 6-десатуразу, могут быть сконструи 9577 рованы методами с использованием технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной специалистам ( и др., 1989), и уже описанной последовательности 12-десатуразы ( и др., 1990,347, 200-203). Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением было установлено, что нуклеотиды 2002-3081 последовательности 1 кодируют 12-десатуразу цианобактерии. Поэтому указанная последовательность может быть использована для конструирования нужных векторов экспрессии. В частности, в качестве трансгенных организмов могут быть использованы коммерчески возделываемые культурные растения,примерами которых являются, не ограничивая, при этом, объема изобретения, подсолнечник, соя, масличный рапс, маис, арахис и табак. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу продуцирования растений, устойчивых к низким температурам. Чувствительность к холоду может быть обусловлена фазовым переходом липидов в клеточных мембранах. Температура фазового перехода зависит от степени ненасыщенности жирных кислот в мембранных липидах, а поэтому, индуцирование или повышение холодоустойчивости растения может осуществлено путем увеличения уровня ненасыщенности, например, посредством введения 6-десатуразы в целях превращенияв. В соответствии с этим, способ настоящего изобретения предусматривает введение ДНК, кодирующей 6-десатуразу, в клетку растения, и регенерацию растения с повышенной устойчивостью к низким температурам из указанной трансформированной клетки растения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, указанным растением является подсолнечник, соя, масличный рапс, кукуруза (маис), арахис или табак. Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеприведенными примерами. Пример 1 Штаммы и условия культивирования(РС 6803, АТСС 27184), (РС 7120, АТСС 27893) и с(РС 7942, АТСС 33912) культивировали в условиях фотоавтотрофии при 30 С в 11 среда( и др., 1979, . . . 111,1-61) при освещении ламп накаливания (60 мкЭ м-2 с-1). Космиды и плазмиды подвергали селекции и культивированию в штамме 5 на В-среде, дополненной антибиотиками при стандартных концентрациях, указанных в работе, (1982),, . Пример 2 Конструирование космидной геномной библиотеки изПолную геномную ДНК из(РСС 6803) частично переваривали ферментом 3 и фракционировали на градиенте сахарозы ( и др., 1987,,). Фракции, содержащие 30-40 к-ДНК-фрагменты, отбирали и лигировали в дефосфорилированный 1-сайт космидного вектора, р 7 ( и др., 1991, . . 173, 1879-1885). Лигированную ДНК упаковывали, как описанои др. (1987), и упакованный фаг размножали в 5 . с, содержащем хелперную плазмиду, кодирующуюЕсо 4711-метилазу, а именно плазмиду рР 528, описаннуюи др. (1991). Всего произвольно было выделено 1152 колоний, которые поддерживали отдельно в двенадцати 96-луночных планшетах для микротитрования. Пример 2 Индуцирование способности к экспрессиив(РСС 7120), которая представляет собой нитевидную цианобактерию, не содержит ,но содержит значительное количество линолевой кислоты, являющейся предшественником(фиг. 2, табл. 2).космидную библиотеку,описанную в примере 2, конъюгировали с(РСС 7120) для идентификации трансконъюгантов,продуцирующих . Клеткикультивировали до середины логарифмического роста в В 11 жидкая среда, и ресуспендировали в той же самой среде до конечной концентрации, составляющей приблизительно 2 х 108 кл/мл. ультуру 4., находящуюся в средней фазе логарифмического роста (, 1979, . .114, 341-348), культивировали в В-среде, содержащей ампициллин, а затем промывали и ресуспендировали в свежей В-среде. После этогои 4 смешивали и равномерно распределяли по(В 11)-чашкам, содержащим 5 В. Космидную геномную библиотеку перепечатывали (т. е. пересевали - прим. пер.) в В-чашки, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 17,5 мкг/мл хлорамфеникола, а затем пятнами наносили на (В 11)-чашки,содержащиеи Р 4. После 24-часового инкубирования при 30 С вводили 30 мкг/мл неомицина и инкубировали при 30 С до тех пор, пока не появятся трансконъюганты. Отдельные трансконъюганты были выделены после конъюгирования и культивирования в 2 мл В 11 жидкая среда с 15 мкг/мл неомицина. Метиловые сложные эфиры жирных кислот получали из культур дикого типа и культур, содержащих пулы 10 трансконъюгантов, следующим образом. Культуры дикого типа и трансгенные цианобактериальные культуры собирали путем центрифугирования и дважды промывали дистиллированной водой. Из этих культур, в соответствии с описаниеми др. (1989) (. . .66, 543-548), экстрагировали сложные метиловые эфиры жирных кислот и анализировали с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), используя хроматограф Тасо-560, снабженный детектором, где источником ионизации является водородное пламя, и капиллярной колонкой (30 м х 0,25 мм, связанной с 7 957711,). Для индентификации жирных кислот использовали время удерживания и кохроматографию стандартов (полученных от). Средний состав жирных кислот определяли как отношение площади пика каждой 18-жирной кислоты, нормализованной по отношению к внутреннему стандарту. Характерные -профили представлены на фиг. 2, где показаны сложные метиловые эфиры С 18-жирных кислот. Пики были идентифицированы путем сравнения времен элюирования известными стандартами метиловых сложных эфиров жирных кислот и подтверждены с помощью хроматогазовой масс-спектрометрией. Фиг. 2 А иллюстрирует ГЖХанализ жирных кислотдикого типа. Стрелкой показано время перемещения . Фиг. 2 В иллюстрирует ГЖХ-профиль жирных кислот трансконъюгантовс рАМ 5421.8. Было идентифицировано, что два -продуцирующих пула (из 25 пулов, представляющих 250 трансконъюгантов) продуцируют . Отдельные трансконъюганты каждого -положительного пула были проанализированы на продуцированиепри этом было идентифицировано, что два независимых трансконъюганта, А 13 и 75 (по одному от каждого пула) экспрессировали значимые уровнии содержали космиды 13 и 75, соответственно(фиг. 3). Эти космиды перекрываются в области,длиной примерно 7,5 к. 1-фрагмент с 3,5 к космиды 75 субклонировали в вектор р 7 и переносили в , в результате чегоприобретала способность экпрессировать(табл. 2). Два/ 111-субфрагмента (1,8 и 1,7 к) 3,5 к - фрагмента 75-3,5 субклонировали в вектор(фиг. 3) для секвенирования. При этом использовали стандартную технику, обычно используемую в молекулярной биологии и описаннуюи др. (1982) ии др. (1987). Дидезокси-секвенирование ( и др., 1977, . . . .74, 5463-5467) 1.8 осуществляли с использованием секвеназы(,) (по обеим цепям) и специфических олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в( ,). Анализы ДНК-последовательностей проводили с использованием программного обеспечения(, ), как описанои др. (1984,12, 387-395). Оба / 111-субфрагмента переносили в конъюгированный вектор экспрессии, АМ 542, как в прямой, так и в обратной ориентациях по отношению к промотору цианобактериальной карбоксилазы, и путем конъюгирования вводили в . Трансконъюганты, содержащие 1,8 к-фрагмент в прямой ориентации (542-1.8), продуцировали значительные количестваи октадекатетраеновой кислоты (фиг. 2, табл. 2). Трансконъюганты,содержащие другие конструкции, либо 1,8-кфрагмент в обратной ориентации, либо 1,7 кфрагмент в прямой и обратной ориентации, не продуцировали обнаруживаемых уровней(табл. 2). На фиг. 2 сравниваются профили С 18-жирных кислот экстракта издикого типа (фиг. 2 А) с профилями трансгенной , содержащей 1,8 к-фрагмент- 75-3,5 в прямой ориентации (фиг. 2 В). ГЖХ-анализ метиловых сложных эфиров жирных кислот от 542-1.8 обнаруживал пик со временем удерживания, равным времени удерживания для аутентичного стандарта. Анализ этого пика с помощью газовой хроматографии - массспектрометрии (ГХ-МС) подтвердил, что он имеет тот же тип масс-фрагментации, что и эталонный образец . По скорости роста и морфологии,трансгенныес измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот идикого типа были идентичными. Таблица 2 Состав С 18-жирных кислот в цианобактерии дикого типа и в трансгенной цианобактерии Штамм 9577 Пример 4 Трансформацияс использованием генов 6- и 12-десатуразы Третью космиду,7, которая содержала ген 12-десатуразы,выделяли путем скрининга- геномной библиотеки с использованием олигонуклеотида, синтезированного из известной последовательности гена 12-десатуразы( и др., 1990,347, 200-203). 1,7 кфрагмент из этой космиды, содержащей ген 12-десатуразы, был идентифицирован и использован в качестве зонда для иллюстрации того факта, что 13 содержит не только ген 6-десатуразы, но и также ген 12-десатуразы(фиг. 3). Кроме того, геномный блот-анализ по Саузерну показал, что оба гена (6- и 12-десатуразы) являются уникальными в геноме , так что оба эти функциональные гена, участвующие в десатурации 18-жирных кислот, являются тесно связанными в геноме . Одноклеточная цианобактерия(РС 7942) не содержит ни линолевой кислоты, ни(3). Гены 12- и 6-десатуразы были клонированы как отдельно, так и вместе, в челночный вектор рАМ 854 ( и др., 1991, . . 174,7525-7633), который содержит последовательности,необходимые для интеграции чужеродной ДНК в геном( и др., 1987,, 153, 215-231).трансформировали с использованием указанных генных конструкций, и колонии отбирали путем селекции. Из трансгеннойэкстрагировали метиловые сложные эфиры жирных кислот и анализировали их с помощью газожидкостной хроматографии. Как видно из табл. 2, основными жирными кислотамидикого типа являются стеариновая кислота (180) и олеиновая кислота (181). Помимо основных жирных кислот, ,трансформированная с помощью рАМ 854-12, экспрессировала линолевую кислоту (182). рАМ 8546- и -12-трансформанты продуцировали линолеат и(табл. 1). Полученные результаты показали,что , содержащая оба гена 12- и 6 десатуразы, приобрела способность к введению второй двойной связи в 12-положение и третьей двойной связи в 6-положение 18-жирных кислот. Однако в трансформантах, содержащих рАМ 854-6,изменения в составе жирных кислот не наблюдалось, что указывает на то, что при отсутствии суб 12 страта,синтезированного посредством десатуразы, 6-десатураза является неактивной. Кроме того, этот эксперимент подтвердил тот факт,что 1,8 к- 1/ 111-фрагмент (фиг. 3) содержит как кодирующую, так и промоторную области гена 6-десатуразы . По своим скорости роста и морфологии,дикого типа и трансгеннаяс измененными уровнями полиненасыщенных жирных кислот являются идентичными. Пример 5 Нуклеотидная последовательность 6-десатуразы Определяли нуклеотидную последовательность 1,8 к-фрагмента 75-3,5, включающего в себя функциональный ген 6-десатуразы. Идентифицировали открытую рамку считывания, кодирующую полипептид в 359 аминокислот (фиг. 4). С помощью гидрофобно-липофильного анализа по методу( и др., 1982, . .157, 105-132) были идентифицированы две области гидрофобных аминокислот, которые должны представлять трансмембранные домены (фиг. 1 А) и, кроме того, было установлено, что профиль гидрофобности и гидрофильности 6-десатуразы аналогичен профилю 12 десатуразы (фиг. 1 Ви др.) и 9-десатураз( и др., 1986, .261, 13230-13235). Однако сходство между последовательностями 6- и 12-десатуразсоставляет менее, чем 40 для нуклеотидных последовательностей, и приблизительно 18 для аминокислотных последовательностей. Пример 6 Перенос гена цианобактериальной 6-десатуразы в растение табака Ген 6-десатуразы цианобактерии вводили в растительный вектор экспрессии и переносили в табак,используя технику -опосредованного переноса гена. Для обеспечения соответствующей экспрессии перенесенного гена десатуразы в листьях и прорастающих семенах растений, а также направленной доставки продукта гена десатуразы в эндоплазматический ретикулум или хлоропласт, конструировали различные полигенные экспрессирующие кластеры, содержащие открытую рамку считывания-десатуразы . Эти кластеры имели следующие компонентыпромотор 35 или семя-специфический промотор, происходящий от гена гелиантинина подсолнечника для контроля экспрессии гена 6-десатуразы во всех тканях растения или только в прорастающих семенах, соответственно,предполагаемый сигнальный пептид,происходящий либо от гена экстенсина моркови,либо от гена гелиантинина подсолнечника для доставки вновь синтезированной 6-десатуразы в эндоплазматический ретикулум (Е)сигнальная последовательность у СООН-конца О 6 десатуразы для удерживания белков в полости ,(К) иоптимизированный транспортный пептид для доставки 6-десатуразы в хлоропласт. Промотор 35 происходит от рРТ 2, описаннойи др. (1990). Последовательность оптимизированного транспортного пептида описанаи др. (1985). Сигнальный пептид экстенсина моркови описани др. (1985, ЕМВО . 9, 2145). Были продуцированы трансгенные растения табака, содержащие химерный ген десатуразы цианобактерии, состоящий из гена 6-десатуразы, сшитого с последовательностью, ответственной за удерживание белков в эндоплазматическом ретикулуме , и сигнальным пептидом 9 9577 экстенсина под контролем промотора 35.-амплификация геномной ДНК трансгенного табака свидетельствовала о том, что ген 6 десатуразы был введен в геном табака. Метиловые сложные эфиры жирных кислот листьев указанных трансгенных растений табака были экстрагированы и проанализированы с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Эти трансгенные растения табака аккумулировали значительное количество(фиг. 4). На фиг. 4 показаны ГЖХ-профили метиловых сложных эфиров жирных кислот. Пики были идентифицированы путем сравнения времен элюции с известными стандартами метиловых сложных эфиров жирных кислот. В соответствии с вышеуказанным, гены цианобактерий, ответственные за метаболизм жирных кислот, могут быть использованы для генерирования трансгенных растений с измененным составом жирных кислот. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фрагмент выделенной ДНК, кодирующий дельта-6-десатуразу цианобактерий, содержащий нуклеотидную последовательность 3 или последовательность 3, имеющую вставки,замещения или делеции, при которых сохраняется дельта-6-десатуразная активность, или последовательность, содержащая нуклеотиды 317-1507 из 1. 2. Фрагмент ДНК, кодирующий дельта-6 десатуразу,имеющий аминокислотную последовательность 2. 3. Вектор, содержащий в направлении 5-3 промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора дельта-6-десатуразы, промотора карбоксилазы, промотора гелиантинина, промотора глицинина и промотора напина, операбельно связанный с фрагментом ДНК по п.п. 1 или 2, операбельно связанным с сигналом терминации, выбранным из группы, состоящей из сигнала терминации , сигнала терминации нопалинсинтазы и семяспецифического сигнала терминации. 4. Способ получения растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты , предусматривающий а) трансформацию клетки растения фрагментом ДНК по п.п. 1 или 2 или вектором по п. 3 б) регенерацию растения с повышенным содержаниемиз указанной клетки растения. 5. Способ индуцирования продукции гаммалиноленовой кислотыв бактериях или растении с дефицитом или отсутствием , предусматривающий трансформацию указанного организма фрагментом ДНК по п.п. 1 или 2 или вектором по п. 3. 6. Способ индуцирования продукции гаммалиноленовой кислотыв организме с дефицитом или отсутствиеми линолевой кислоты, предусматривающий трансформацию указанного организма фрагментом ДНК по п.п. 1 или 2 или вектором по п. 3 и изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу. 7. Способ индуцирования продукции гаммалиноленовой кислотыв организме с дефицитом или отсутствиеми линолевой кислоты, предусматривающий трансформацию указанного организма, по меньшей мере, одним вектором экспрессии по п. 3 и изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу. 8. Способ по п. 7, в котором указанное растение является подсолнечником, соей, кукурузой, табаком,арахисом или рапсом. 9. Способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты в бактериях или растении с дефицитом или отсутствием гамма-линоленовой кислоты, предусматривающий трансформацию указанной бактерии или растения с помощью фрагмента ДНК по п.п. 1 или 2. 10. Дельта-6-десатураза цианобактерий, имеющая последовательность 2. Приоритет по п.п. 1-5 и 10 от 10.10.91, по п.п. 69 от 08.01.92. 9577 Данные последовательности 1 Характеристики последовательности Длина 3588 пар оснований Тип нуклеиновая кислота Цепочечность обоих типов Топология линейная Тип молекулы ДНК (геномная) Отличительная особенность Название/Ключ С Локализация Описание последовательности 1 9577 Данные последовательности 2 Характеристики последовательности Длина 359 аминокислот Тип аминокислота Топология линейная Тип молекулы белок Описание последовательности 2 Данные последовательности 3 Характеристики последовательности Длина 1884 пар оснований Тип нуклеиновая кислота Цепочечность обоих типов Топология линейная Тип молекулы ДНК (геномная) Описание последовательности 3