Адъювант растительного происхождения

(51) 61 39/12 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения заключается в получении спиртового экстракта из семян растенияс последующим фракционированием экстракта методом хроматографии высокого давления , выделением сапонинсодержащей фракции и ее лиофильным высушиванием. Полученный растительный препарат содержит малотоксичные иммуностимулирующие сапонины в количестве не менее 70 от сухой массы конечного продукта и обладает способностью эффективно стимулировать гуморальный,клеточный и защитный иммунитет против вирусных и паразитарных инфекций. Преимущества предлагаемого адъюванта растительного происхождения перед существующими заключаются в низкой токсичности,эффективности действия при использовании различных антигенов вирусного и паразитарного происхождения, доступности сырья для получения препарата, меньшей стоимости продукта по сравнению с импортным аналогом. Предлагаемое иммуностимулирующее средство,выделенное из растения флоры Казахстана,позволяет расширить арсенал препаратов для повышения эффективности вакцин и может быть использовано в качестве импортозамещающего средства в медицинской и ветеринарной практике.(72) Богоявленский Андрей Павлинович Березин Владимир Элеазарович Худякова Светлана Сергеевна Зайцева Ирина Алексеевна Омиртаева Эльмира Серикказыновна Коротецкий Илья Сергеевич Алексюк Павел Геннадьевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Использование медицина, ветеринария, а именно разработка новых иммуностимулирующих средств для повышения иммуногенности вакцин. Целью изобретения является получение нового малотоксичного иммуностимулирующего препарата для повышения иммуногенности вакцин, который мог бы найти применение в медицинской и ветеринарной практике. 23380 Известен сапонинсодержащий экстракт из растения, который способен стимулировать иммунный ответ на введенный антиген (патент 6,241,9955, 2001,.,В.,.,В.). Недостатками данного препарата являются малая доступность импортного сырья и высокая стоимость препарата. Известен этанольный экстракт, содержащий флавоноиды, из растения,который способен активировать иммунный ответ(патент , заявка 99108701/14, Шульц Э.Э.,Толстиков Г.А., Петрова Т.Н., Толстикова Т.Г.,Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р.). Недостатками данного препарата являются достаточно высокая токсичность, обусловленная токсичностью флавоноидов, а также относительно низкая иммуностимулирующая активность. Известна иммуностимулирующая активность стероидных сапонинов, выделенных из растения( .,.,., .,.,. . ./2//. . - 2009. - .121, 2. - .241-247). Недостатком данного препарата является его недоступность для потребителя. Известна фракция иммуностимулирующих сапонинов, (коммерческое название сапонин Квил А), выделенных из южно-американского дереваи представляющая собой смесь тритерпеновых сапонинов. На основе этих сапонинов получены иммуностимулирующие комплексы ИСКОМ , в состав которых входят антиген, холестерол, фосфолипиды и растительные сапонины. ( ,.-.,.-.,//. -200. - . 8,3. -.153-16). Сапонин Квил А производится фармакологическими фирмами в Даниии Швеции( ). Данный препарат входит в состав ряда ветеринарных вакцин и находится на стадии клинических испытаний, как компонент вакцин медицинского назначения. Сапонин Квил А из коры дереваявляется наиболее близким аналогом по отношению к заявляемому изобретению. Недостатками указанного препарата являются достаточно высокая токсичность, высокая стоимость препарата, малая доступность для отечественного рынка вакцин. Задачей изобретения является получение нового малотоксичного иммуностимулирующего препарата, который мог бы найти применение в медицинской и ветеринарной практике для повышения иммуногенности вакцин. Данная задача достигается путем получения иммуностимулирующего препарата в виде лиофильно высушенной фракции сапонинсодержащего экстракта, полученного из семян растения. Сущность изобретения заключается в получении спиртового экстракта из семян растения 2 с последующим фракционированием экстракта методом хроматографии высокого давления , выделением сапонинсодержащей фракции и ее лиофильным высушиванием. Полученный растительный препарат способен эффективно стимулировать гуморальный,клеточный и защитный иммунитет против вирусных и паразитарных инфекций. Преимущества предлагаемого адъюванта растительного происхождения перед существующими заключаются в низкой токсичности, эффективности действия при использовании различных антигенов вирусного и паразитарного происхождения,доступности сырья для получения препарата,меньшей стоимости продукта по сравнению с импортными аналогами. Предлагаемое иммуностимулирующее средство, выделенное из растения флоры Казахстана, позволяет расширить арсенал препаратов для повышения эффективности вакцин и может быть использовано в качестве импортозамещающего средства в медицинской и ветеринарной практике. Препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета без запаха,гигроскопичен, при хранении комкуется. Растворим в воде очищенной, 50 ацетонитриле, 30 растворе кислоты уксусной и 10 растворе натрия гидроксида, мало растворим в эфире диэтиловом,практически нерастворим в бензоле и хлороформе. Подлинность препарата подтверждается с помощью 5 качественных реакций а) обработка раствором метилового красного в этаноле позволяет обнаружить в растительном экстракте наличие органических кислот (красное окрашивание) б) обработка 3,5 динитросалицилатом с последующим нагреванием при 105 С позволяет определить наличие восстанавливающих сахаров (черное окрашивание) и невосстанавливающих сахаров (серо-зеленое окрашивание) в) обработка 0,5-ным раствором йода в хлороформе позволяет обнаружить основания и липиды (коричневое окрашивание) г) обработка раствором аммиака позволяет обнаружить флавоноиды(желто-коричневое окрашивание) д) обработка 2-ным раствором 3 в метаноле позволяет определить сапонины(пурпурное окрашивание). Сущность изобретения поясняется на следующих примерах. Пример 1. Для получения адъюванта растительного происхождения из растенияиспользуют измельченные семена размером частиц диаметром 2-4 мм. Измельченные семена обрабатывают 2-3 раза 5-кратным объемом хлороформа при комнатной температуре в течение 1,5 часов. После удаления хлороформа семена растения экстрагируют 3-кратным объемом 7585 этанола в течение 18 часов при комнатной температуре. Полученный экстракт лиофильно высушивают и используют для фракционирования. Очищенные сапонины получают путем фракционирования методом хроматографии высокого давления . Разделение проводят в 23380 градиенте ацетонитрила 0-80 в присутствии 0,1 трифлуороуксусной кислоты (ТФА) на колонке 18, 5, 9,4250 мм. На колонку наносят 500 мг экстракта, разведенного в 1 мл дистиллированной воды. Контроль за хроматографическим процессом осуществляют спектрофотометрическим методом при длинах волн 208 нм и 353 нм. Отбирают фракцию с наибольшим поглощением оптической плотности при 208 нм(зона поглощения сапонинов) и наименьшим поглощением при 353 нм (зона поглощения флавоноидов). Полученный препарат лиофильно высушивают. Контроль содержания препарата проводят с помощью цветной реакции на сапонины и путем хроматографического анализа. При хроматографическом анализе в препарате выявляется основной пик при длине волны 208 нм,соответствующий сапонинам. Содержание сапонинов в конечном препарате должно составлять не менее 70 от сухой массы. Пример 2. Токсичность полученного препарата сапонинов из растенияопределяют на модели белых мышей, однодневных цыплят, 9 дневных куриных эмбрионах. Токсичность определяют с помощью подкожного или интраназального введения исследуемого материала в объеме 0,2 мл мышам и цыплятам (токсичность на животных) или путем инокуляции 0,2 мл препаратов в хорион-аллантоисную полость куриных эмбрионов (эмбриотоксичность). Токсичность полученного препарата сопоставляют с токсичностью коммерческого препарата, сапонина Квил А, производства компанииАВ, Швеция (таблица 1). Результаты таблицы показывают, что заявленный препарат является менее токсичным по сравнению с коммерческим препаратом сапонина Квил А. Пример 3. Активность стимуляции гуморального иммунитета определяют при иммунизации однодневных цыплят антигенамив сочетании с препаратом сапонинов, полученным из растения. Антигеныв дозе 10 мкг/цыпленок смешивают с сапонинсодержащим препаратом в дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизируют однократно путем интраназального введения исследуемого препарата. Для сравнения цыплят иммунизируют антигенамибез иммуностимулятора и антигенамив сочетании с коммерческим иммуностимулятором гидроокисью алюминия в тех же дозах. Через 2 недели после иммунизации производят забор крови цыплят для определения уровня антител. Антитела определяют с помощью иммуноферментного анализа. Результаты испытаний приведены на рисунке 1. Показано, что иммунизация цыплят антигенамив смеси с полученными сапонинами из растенияприводит к значительно большему подъему уровня антител в крови цыплят по сравнению с иммунизацией антигенами без иммуностимулятора или антигенами в сочетании с коммерческим иммуностимулятором гидроокисью алюминия. Пример 4. Активность стимуляции клеточного иммунитета определяют при иммунизации белых мышей весом 18-20 г антигенамив сочетании с препаратом сапонинов, полученным из растения. Антигеныв дозе 10 мкг/мышь вводят подкожно в сочетании с препаратом сапонинов из растения, а также в смеси с коммерческими адъювантами (полный и неполный адъюванты Фрейнда, гидроокись алюминия). Мышей также иммунизируют антигенамибез адъювантов. Через неделю после второй иммунизации у мышей собирают кровь и в сыворотках определяют наличие цитокинов -, -2, -4, -10. Цитокины выявляют методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тестсистем фирмы(США). Результаты анализов приведены на рисунках 2 и 3. Показано,что иммунизация животных антигенамив сочетании с сапонинсодержащим препаратом из растениястимулирует значительно более высокий уровень клеточного иммунитета по сравнению с иммунизацией очищенными антигенами без адъюванта или антигенами в смеси с адъювантом гидроокисью алюминия. Активность образования цитокинов после иммунизации антигенамив сочетании с препаратом сапонинов из растениясопоставима с активностью цитокинов после иммунизации антигенами в смеси с коммерческими масляными адъювантами (полный и неполный адъювант Фрейнда). Однако после подкожной иммунизации мышей антигенами в смеси с масляными адъювантами наблюдается развитие значительных местных токсических реакций у животных (стерильные абсцессы), чего не происходит при использовании сапонинсодержащего препарата из растения. Пример 4. Активность гуморального иммунитета определяют при подкожной иммунизации белых мышей массой 18-20 г антигенами вируса болезни Ньюкасла(ВБН),штамм ПМВ 1/курица/Талдыкурган/346/03 в сочетании с сапонинсодержащим препаратом из растения. Изолированные гликопротеидные антигены ВБН в дозе 10 мкг/мышь смешивают с сапонинсодержащим препаратом из растенияв дозе 10 мкг/мышь. Для сравнения мышей иммунизируют изолированными гликопротеидами ВБН в сочетании с коммерческими препаратами гидроокиси алюминия и сапонина Квил А, а также изолированными гликопротеидами без адъюванта. Мышей иммунизируют двукратно, повторное введение вакцинных препаратов проводят через 3 3 23380 недели той же дозой антигена. Сыворотки получают через 1 неделю после второй иммунизации и определяют содержание , ,и подклассов- 2, 2 в крови мышей. Для выявления антител используют меченые пероксидазой хрена моноклональные антитела к определенным классам и подклассам . Результаты анализов приведены в таблице 2 и на рисунке 4. Показано, что иммунизация животных антигенами вируса болезни Ньюкасла в сочетании с сапонинсодержащим препаратом из растениястимулирует значительно более высокие уровни антител классов , , и антител подклассовпо сравнению с иммунизацией очищенными антигенами ВБН в сочетании с гидроокисью алюминия, наиболее известным и часто применяемым для вакцинации иммуностимулятором. Также установлено, что титры различных классов иммуноглобулинов и подклассовпосле иммунизации вакцинным препаратом, содержащим иммуностимуляторы из растения, сопоставимы с титрами антител после иммунизации вакциной,содержащей в качестве адъюванта сапонин Квил А,при значительно меньшей токсичности заявляемого сапонинсодержащего препарата из растения. Пример 5. Активность гуморального иммунитета определяют при иммунизации однодневных цыплят вакциной на основе изолированных гликопротеидных антигенов вируса гриппа птиц(ВГП), штамм // /34 в сочетании с сапонинсодержащим препаратом из растения. Гликопротеиды ВГП в дозе 10 мкг/цыпленок смешивают с сапонинсодержащим препаратом в дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизируют однократно путем интраназального введения исследуемого препарата. Для сравнения цыплят иммунизируют антигенами ВГП без иммуностимулятора и антигенами ВГП в сочетании с адъювантами гидроокисью алюминия и сапонином Квил А. Через 2 недели после однократной иммунизации кровь цыплят собирают для определения уровня иммуноглобулинов - , , . Наличие иммуноглобулинов определяют с помощью иммуноферментного анализа с использованием меченых пероксидазой моноклональных антител. Результаты испытаний приведены на рисунке 5. Показано, что однократная иммунизация цыплят изолированными гликопротеидами ВГП в смеси с сапонинсодержащим препаратом из растенияиндуцирует более высокие титры иммуноглобулинов классов А, М ипо сравнению с иммунизацией антигенами без иммуностимулятора или антигенами в сочетании с коммерческим адъювантом гидроокисью алюминия. Активность образования различных классов иммуноглобулинов после иммунизации ВГП в смеси с сапонинсодержащим препаратом из растениясопоставима с активностью образования иммуноглобулинов после 4 иммунизации ВГП в смеси с коммерческим препаратом сапонина Квил А. Пример 6. Активность протективного иммунитета определяют после иммунизации цыплят вакциной против вируса болезни Ньюкасла (ВБН), штамм ПМВ-1/курица/Талдыкорган/346/03 в условиях экспериментального заражения цыплят. Антигены ВБН в дозе 10 мкг/цыпленок смешивают с сапонинсодержащим препаратом из растенияв дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизируют однократно путем интраназального введения исследуемого препарата. Для сравнения цыплят иммунизируют антигенами ВБН в сочетании с сапонином Квил А, и антигенами без адъюванта. Через две недели после однократной иммунизации цыплят заражают гомологичным вирусом, штамм ПМВ-1/курица/Талдыкорган/346/03 в дозе 107 ЭЛД 50/цыпленок. Специфическую гибель цыплят учитывают в течение 21 дня после заражения. Результаты оценки протективной активности различных вакцинных препаратов, представлены на рисунке 6. Показано, что иммунизация цыплят антигенами ВБН в сочетании с иммуностимулирующим сапонинсодержащим препаратом из растенияиндуцирует защиту от массированного летального заражения ВБН у 60 цыплят. Для сравнения аналогичная иммунизация антигенами ВБН в смеси с коммерческим препаратом сапонина Квил А,также защищает от заражения 60 цыплят, но при более высоком уровне токсичных реакций, а иммунизация вакциной без адъювантов индуцирует протективный иммунитет только у 20 цыплят. Пример 7. Активность протективного иммунитета определяют после иммунизации цыплят вакциной против вируса гриппа птиц (ВГП), штамм ///34 в условиях экспериментального заражения цыплят. Антигены ВГП в дозе 10 мкг/цыпленок смешивают с сапонинсодержащим препаратом из растенияв дозе 10 мкг/цыпленок. Цыплят иммунизируют однократно путем интраназального введения исследуемого препарата. Для сравнения цыплят иммунизируют антигенами ВГП в сочетании с коммерческим препаратом сапонина Квил А, а также антигенами без адъювантов. Через две недели после однократной иммунизации цыплят заражают гомологичным вирусом гриппа птиц, штамм // /34 в дозе 100 ЭЛД 50/цынленок. Специфическую гибель цыплят учитывают в течение 21 дня после заражения. Результаты оценки протективной активности различных вакцинных препаратов, представлены на рисунке 7. Показано, что иммунизация цыплят антигенами ВГП в сочетании с 23380 иммуностимулирующим препаратом из растенияиндуцирует защиту от летального заражения вирусом у 70 цыплят. Иммунизация антигенами ВГП в смеси с коммерческим препаратом сапонина Квил А,защищает от заражения 87,5 цыплят при более высоком уровне токсических реакций. Иммунизация очищенной субъединичной вакциной без адъювантов индуцирует протективный иммунитет только у 40 цыплят. Таким образом,иммуностимулирующий сапонинсодержащий препарат из растенияможет быть эффективно использован в качестве адъюванта для повышения иммуногенности вакцин, содержащих различные антигены паразитарного и вирусного происхождения и усиления их защитных свойств при меньшей токсичности данного препарата по ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Адъювант растительного происхождения,обладающий способностью стимулировать гуморальный, клеточный и защитный иммунитет при иммунизаии различными антигенаит,отличающийся тем, что используют лиофильно высушенный малотоксичный сапонинсодержащий препарат, полученный из растенияпутем спиртовой экстракции с последующим фракционированием хроматографией высокого давленияи лиофильным высушиванием, при содержании сапонинов в конечном продукте не менее 70 от сухой массы препарата.