Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В

Изобретение относится к способу получения поверхностного антигена гепатита В путем микробиологического. синтеза, который может быть.использован в медицинской промышленности для изготовления вакч цины против гепатита В.Известны вакцины против гепатита В на основе НВ 54 антигенаиз сыворотки доноров (ТаЬог Е.еЪ а 1 д.тео у 1 го 1.1 ЭВ 2,уо 1 1 О,р.Б 5 т 74). Однако, такие вакцины небезопасны для человека, так какмогут соде-рт жать инфекционные частицы гепатита В и могут. быть контаминированы другими вирусами, например, ретровирусами, содержащимися в сыворотке.Способ получения вакцин из сывороток является многостадийным,содержит 2-3 стадии инактивации, а выход поверхностного антигена не превышает 01.Известен способ получения НВ 5 антигена из штаммапродуцентадрожжей, заключающийся в культивировании штаммапродуцента в среде с богатым содержанием фосфора, в переносе клеток в среду с низким содержаниемфосфора для репродукции НВ 5 антигена с последующим отмыванием клеток на центрифуге с проточным ротором. далее клеточную пасту, освобожденную от среды, разводят до исходного объема фосфатнымбУФЕРОМ. И РЗЗРУШВЮТ КЛЕТКИ С ПОМОНДЬЮ ГОМОГЕНИЗЗТОРЗ ВЫСОКОГО ДЗВЛОНИЯ- КОНЕЧНЫЙ ПРОДУКТ ПОЛУЧЗЮТ С ВЫХОДОМ И С СОДЕРЖЗНИЕМ ПРИМЕС,ногобелка до 20, что делает его применениев качестве вакцины не возможнымЬдагрЬег Д, е 1 5.1, РМАБ, 1955, уо 1 А.В 2,р 6330)Известен также способ получения рекомбинантной вакцины гепатитастадии синтеза НВ 5 антигена, не содержащей фосфат, и выделение анти ГЕНЗ Е ИСПОЛЬЗОБЗНИЕМ ДСОРбЦИОННОЙ КРОМЗТОГРЗФИИ НЕ ПОРИЕТЫХ КРЕМ-днеземаи-с злюцией бикарбонатным буфером .рН Э.1 Э.5 с последующимцентрифугированием в градиенте плотности 50 тартрат К(Ма) 25 глицерин при соотношении компонентов 11 (Авторское свидетельство СССР Ы 1 ЗЭ 9 О 6 Окл.АБКНЗЭ/2919 ВВг.). Недостатком данного способа явцляется-низкий выход поверхностного антигена гепатита В после стадии ферментации и разрушение (2 ООЗООмкг антигена с 1 л Ферментера).для получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В с хорошим выходом при использовании снрья различного происхождения в способе получения рекомоинантного поверхностного антигена гепатита В,включающем культивирование и инкубацию штаммапродуцента дрожжей днаПИТЗТОЛЬНОЙ СРЕДЕ С ПОСЛЕДУЮЩИМ РЗЗРУШЕНИЕМ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ И ВЫДЕЛЕдят на питательной среде. содержашей пептон и дрожжевой экстракт.с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора в питатель ной среде дО 20 Отмг/л, а инкубацию проводят в питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечнойсуммарной концентра цией неорганического фосфора в питательной среде 5-50 мг/л. н Использование настадии культивирования дрожжей и биосинтеза антигена питательной среды, лимитированной по неорганическому Фосфору в указанных пределах. позволяет получать оптимальный выход анти ГЕНО НЕЗЗВИСИМО ОТ ВИДЗ СЫРЬЯ.ПРИ КУЛЬТИВИРОВЗНИИ ИСПОЛЬЗУЮТ ЩТЗММ ДРОЖЖЕЙ, СОДЕРЖЗЩИЙ РЕКОМбинантную плазмиду с геном НВвА 9 и способную продуцировать иммуноген ный НБ 5 А 9- В качестве такого исходного штамма может быть использован любой штамм дрожжей продуцент Нввдэд например, штамм Басспаготусез сегеуйзйае ВВУ 746/рМНЧ 64 Б полученный включением трансформированной плаэмиды Ч рММЧС 46 в реципиентный штамм ВВУ 746 е Плаамида рММЧС 4 Б получена путем генноинженерной модификации из иавестнойИзобретение иллюстрируется следующими примерами.В биореактор с рабочим объемом 1 Ол содержащим Эл стерильной среды состава (мас.) пептон из кислотного гидролиэата казеинасодержанием неорганического фосфора 2.О 2.5 мг/г 1.О глюкоза2 о содержащей фосфора неорганического 40-42 мг/л при рН 5.О 5.5вносят культуру дрожжей 8.с. ОВУ 7 чБ/рММЧС 46 в количестве 1.Ол выращенную на минимальной среде (приложение 1) и имеющую титр клеток 4.1 н 1 О 7 Ц смз культуральной жидкости. Культивирование ведут /при температуре 29 т 1 С в течение 26 часов Получают накопительную культуру с титром клеток 2.О 1 Оа кл/смз культуральной жидкости.. Культуру клеток в количестве 1 Ол переносят в Биореактор с рабо чим объемом 1 О 0 л содержащий Эоел стерильной питательной среды сос таза (мас.ц) пептон.из кислотного гидролизата казеина (отечествен ный) с исходным.содержанием неорганического фосфора 05 О.6 мг/г 1.5 экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным с содержанием неорганического фосфора 2.О 2.5 мг/г. глюкоза е 2.0, соли.микроэле менты. витамины (приложение 2), содержащей фосфора неорганического 5.О 6.0 мг/л при рН 5.56.О. Культивирование ведут при температуре 30 С е течение 22 часов.Культуральную жидкость с содержанием клеток 1.41 Ов кл/смз подают на проточную центриФугу типа Не 5 Ьа 11 а со скоростью протока 500 л/ч. клеточную пасту освобождают от среды промыванием О.О 5 М карбонатным буфером с рН 9.0 методом микрофильтрации с использованиемОТМЫВКВЙ В бУФРЕ ТОГО ЖЕ состава С. ПОСЛЕДУЮЩИМ ОТДЕЛЕНИЕМ биомассынапроточнои центрифуге типа Ие 5 Ьга 11 а при скорости протока 500л/час. Получают 1.2 кг биомаосы которую суспендируют в 10 л карбо ьпомощью гомогенизатора типа Сац 11 п АРУ при давлении 6 ОО 70 О атм в 3содержание антигена. Титр антигена составляет 20 мкг/мл осветленногожидкости. Содержание НВ 5 А 9 определяют методом иммуноферментного анатллиза с использованием наборов Аььрьъ Ац 5 зуте 11.Антигенную актив ность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности Нвядо (ОСО 4228153 ВВ), выпускаегеле О ВООСТЗНЗВЛИВЗЮЩИХ УСЛОВИЯХ РЕКОМОИНЗНТНЫЙ ЗНТИГЕН ПРЕДСТЗВЛЕНчасов Получают накопительную культуру с титром- 2.В 1 ОВ кл/смв виде полосы мономера 24-КВ. Иммуноспецифичность этой полосы пока зана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих антиНВ 5 меченных йодом 125.В оиореактор с Эл стерильной питательной среды состава (мас.и) пептон (фирмы ДИФКО 1 с исходным содержанием неорганического.ФосФора 4.55.0 мг/г Ф 2.0 зкстракт дрожжевой (фирмы дИФКО 3 с исходным. со держанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1.0 глюкоза 2.0,содержащей фосфора неорганического 1 Э 52 ОО мг/л. при рН 5.О 55 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л выращенную на минимальной среде (приложение 1) и имеюоую титр 4.41 О 7 кл/смз культуральноижидкости. Культивирование ведут при температуре 291 С в течение 24