Способ получения коньюгата трансферина с колхамином

Изобретение относится к области получения белового конъюгата колиамна а иенно трансферрина с нолхамином нового биологичес ни активного соединения, обладающего противоопухолевой активностью. Известн конъюгаты видезиа и винбластиа с трансферрином а танже с антителами против огфвтопротеина и антигеном эмбриональной карцшомв пат.Велнобритани П 2090837 кл. 007 С Т/00,1982. пат. США Н.4522750 кл.С 07 6 Т/00,1985. Эти конъюгатв обладают противоопухолевой активностью однако. и биологическая активность.эткэначигедана.Наиболее близки по технической сущности. доститаемом результату является способ получения нонъюгата трансферриа с колицином,обладающего противоопухолевой активностью. Способ включает две стадии стадию получения производного колшицина - гидроноисукцинилмдного эфира колхицидилраланина стадию взаимодействия производного колхицина с трансферриом при рН 8,5 и нейтрализации избытка гидро ксиоукцинимдного эфира колипцидил-6 аланма Айтхожина Н.А., Есселеев Е.О Тойбаева Н.А. Авт.свид.СССР, Ы.16 З 9 О 0 З, 007 К 17/00,А 61 Н 31/47, 19901.Задачей предполагаемого изобретения является разработка нового аффективного способа синтеза нового конъюгата траНСБРРНна с колхаммном, обладающего противоопухолевой активностью. Технически результатом является упрощение способа за счет устранения операции получения нолиидил-В-аланина.Исходное соединение нолхаммн - известное производное колхицина. у которого отсутствует ацетильная группа в положени С-7 В кольца алкалоида. Таким образом колхаммн является деацетилированнм производным колхицина, который также обладает противоопухолевойактивностью и применяется в виде омаиновои мази наружно. Однако,широкое использование колхамна в хиотерапии опухолей ограничено изза высокой токсичности.Для синтеза конечного продукта необходимо получение промежуточного соединения Нсукцинилколхамна, с целью повышения реакционноспо собности углеродного атома в 0-7 полонени алкалоида.Н-сукцнилщолиаям. Реакцю конденсации колхамина с янтарнымангидридом проводят в абсолютном пиридина при кометной тамера туре. Для этого 3,7 г. колхамна растворяют В 20 мл абсолютного пиридина, добавляют 2 г ятарного ангидрида. Реакционную смесь оставляют на 36 42 часа. Затем в реакционную смесь добавляют 50 мл 0,1 Н паон, продукт реакции избирательно экстрагируют хлороформом. Сухой остаток после отгонки хлороформа промывают абсолютнм эфиром. Образовавшийся светложелтнп осадок сушат над кагзод. Полученное аморфное вещество хорошо растворяется в этаноле, хлороформе и плохо-в воде. Чистоту препарата определяют хроматографически в двух системах растворителей, в которых значения ат вещества равнялись 0.4 в системе бутанолуксусная кислотавода (БУВ)411 и 0,02 в системе хлороформэтаноламмиак 9091. УФ спектр этого соединения имел два максимма поглощения при длине вол 248 и 351 нм, которни соответствовал спектру колхамина что подтверждает целостность трополонового ядра алалоида. Структуру предлагаемого соединения устанавливали данными тонкослойной хроматографии (ТСХ) бумажного электрофореза, УФи ЯМРспектр 0 сК 9 пначение Н ТСХ определяли на пластинках А 1 и 3 гат ирмн Наспегеу Ыа 3 е 1Электрофоретическую подвижность определял на бумаге РН 16 в0,02 М ПН 4 НС 03 рН Т,5 с использованием приновой кислоты вд качестве маркера, велчина составляла 0,6. В ЯМспектрах наблюдал следующие сигнал(СП 30 В м.д.ж 3,71(3 Нс О-1 ОСНЗ) 399(3 Нс опа ООНЗ) 4,02(3 Нс 03 ОСНЗ) 4,15(3 Н,с. С 10 ООНЗ) ароматические протоны 649758 м.д. В Уфа спектрах наблюдали максимумы поглощения при А 243, 351 и 423 н.Белов конъптат. Конъюгацию проводили инкубированем раотвод вора бела трансферрина и Ысукциноилолиамина. Для етогоето мл 20 раствора трансферрина в трисНБ 1 буфере рн 5 добавляют около 1 мл М раствора НаН 003 до рН 7,8 8,0. затем осуществляют каждые 15 минут дозированное введение ЫсукЦиноилколхамина по 15 мил 0,2 М раствора. Инкубацию проводят на магнитной мешалке при комнатной температуре и определяют степень сшвки белка с активированным алиалоидом через каждые 15 миут инуоации. От низкомолекулярных примесей освобождаются элюциеи полученного конъюгата на колонке с Тоуореаг 1 НЩ 55. Профиль елюции белкового конъюгата колиамна представлен на рис. 1.Очищениий беловый преидра проверяют на степень сшивки целевого соединения с трансферрино . Результаты о количестве свяеавшегося ЫсукциНоилколхамина представлены графически на рис.3. На УФспект рах (рис.Ъ) имеются максиуми поглощения при 280 и 354 нм, что свидетельствует о наличи в молекуле конъюгата алкалоида.Из рисунка видно, что при получении конъюгата ядро молекулы алкалоида не подвергается изменению. молекулярную массу конъюгата определяют на колонке с Тоу 0 реаг 1 НЧ-55. Значение Вт соответст вует оелиу о молекулярной массой 79000 дальтон. Обработка конъюгата детергентом с последующим диалеом Не вляет Ни на УФспектрН ни на соотношение колхамнбелок, что свидетельствует о ковалентном связывании алалоида с селом.Определение противоопухолевой активности проводят на культуре клеток Не 1 а. Клетки культивируют на среде ДММ с добавлением 10ЭМбрТ/ЮНЭЛЬНОЙ СНВОРОТНИ ТЭЛЭЪШЭ. СУСПВНЗИЮ КЛВТОК РЭССВВЭЮТ на 35Луночнне планшеты с плотностью 105 клеток на 1 мл. Через сутки В ячейки вносят растворы конъюгатов с концентрацией от 1 ОБ до 1 О 4 М. Через трое суток наносили 3 НТИМШДИН В концентрации 1 мню/мл,инкубировали 4 часа. Регистрацию включение радиоактивного тимдинапроводили в толуольном сцинтилляторе, Предварительно осадив ДНК нафильтре ЕР/С. Результаты представлены в таблице 1 в виде 1 В 5 О 4 ци 6 ольмемо активность на клетках Не 1 а полученные конъюга тьщ показали при соотношениях алкаебЭти же соотношения алалоидоелок были использованы для определения процента торможения роста опухоли асцитнои карциномы яичников крыс 1 п 7170. В опнтахиспользовались 100 граммовые белые крысы, а концентрации колшамина В конъюгете составлял 1 5 150 мт/кг (см. табл. 2 и 3).Для изучения действия колхамна и его белковых конъюгатов не опухолевые клетки 1 п 7170 были поставлены два отдельных эксперимента с иопольеованем перевиваемой асцитнои карциономн яичника крыс Л.Ф.Ларионов Химотерапя злокачественх опухолей. м.Медицина 19623.В ОДОМ ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ОПРЭДЭЛНЛИ размеры И ПРОЦЭНТ