Способ повышения иммунного статуса осетровых рыб.

(51) 01 61/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ повышения иммунного статуса осетровых рыб осуществляют методом купания в растворе препарата, отличающийся тем, что обработку проводят одно или двухкратым опытом иммуностимулирующим препаратом Ронколейкин, в различных дозахв расчете на 1 г живой массы рыб различного возраста, роста, развития и клинического состояния в виде одноразового купания в течение 30 минут в ванне с водой, с температурой 20 градусов, рН - 8,6 и принудительной аэрацией. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в иммунной коррекции организма и стимуляции ускоренного роста и развития, раннего становления, дифференцировки и развития органов иммуногенеза отстающих в развитии и повышения жизнестойкости организма ослабленных рыб.(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт рыбного хозяйства// Аквакультура осетровых рыб Достижения и перспективы развития. Астрахань, 2004, с. 132-133(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ОСЕТРОВЫХ РЫБ(57) Изобретение относится к ихтиопатологии и может быть использовано в рыбоводных хозяйствах,занимающихся выращиванием рыб в условиях бассейнов для зарыбления молоди рыб в естественные водоемы и товарного рыбоводства Изобретение относится к ихтиопатологии и может быть использовано в рыбоводных хозяйствах,занимающихся выращиванием рыб в условиях бассейнов для зарыбления молоди рыб в естественные водоемы и товарного рыбоводства. Искусственное воспроизводство ценных видов рыб необходимо для восполнения рыбных запасов естественных водоемов, в связи с ухудшением за последние десятилетия экологии окружающей среды, возрастанием вылова рыб и другими причинами. Несмотря на постоянное усовершенствование рыбоводными предприятиями технологий выращивания осетровых рыб, их выживаемость при зарыблении в рыбоводные водоемы остается все еще низкой. Для повышения жизнестойкости выращиваемых рыб становится необходимостью применение безопасных препаратов, мобилизующих внутренние резервы самого организма рыб оказать позитивное воздействие для поддержания их жизнестойкости в естественных водоемах. Предлагаемый способ - повышение иммунного статуса осетровых рыб существенно повышает жизнеспособность выращиваемых рыб,их конкурентоспособность в природных условиях и эффективность искусственного воспроизводства рыбоводных заводов. Известен способ повышения иммунного состояния рыб и рыбообразных за счет увеличения резистентности личинок и молоди рыб к воздействию стрессорных факторов различной природы путем обработки их биологическим активным веществом, выделенным из ткани пинеальной железы. Указанный биотехнологический процесс достигается тем, что личинки или молодь рыб и рыбообразных выдерживают в водном растворе биологический активного вещества, представляющего собой комплекс пептидов,полученный путем лиофилизации кислотного экстракта ткани пинеальной железы крупного рогатого скота, в течение 1 - 1,5 часа при концентрации раствора 1050 мг/л. Выдерживание личинок и молоди рыб и рыбообразных в водном растворе комплекса пептидных фракций, полученного из пинеальной ткани, основано на том, что пептиды, проникая в организм рыб и рыбообразных, вызывают изменения метаболических процессов,способствующих оптимизации механизмов нейроэндокринной регуляции жизнедеятельности. В результате повышается адаптация организмов к воздействию стрессорных факторов различной природы и тем самым повышается жизнеспособность рыб и рыбообразных. Недостатком данного способа является трудоемкость получения и изготовления биологически активного вещества из пинеальной железы крупного рогатого скота. Способ представляет определенные сложности при вычислении процентного отношения выживших личинок, участвовавших в опыте. Данный способ не исключает гибель определенной части личинок, 2 подвергшихся к воздействию данного биологически активного вещества.(Баранникова И. А. и др. Способ повышения жизнеспособности рыб и рыбообразных на ранних стадиях развития // Авторское свидетельство СССР 1286138, кл. А 01 К 61/00, 1987) Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ купания в биологической активном веществе Вокс икры и молоди осетровых рыб, который выбран за прототип. Обработка препаратом осуществлялась методом купания икры раствором препарата и путем его добавления в корм. Объектом исследования являлись икра севрюги, личинки и молодь белуги, а также годовики осетра и севрюги. Оценка влияния препарата ВОКС проводились по иммунорезистентным реакциям,рыбоводнобиологическим и гистологическим показателям. Изучение влияния препарата проведены методом купания в растворе препарата и добавкой его в корм. Обработка купанием икры севрюги на определение выживаемости эмбрионов проведена на этапах ее оплодотворения и отмывки, большой желточной пробки, массового выклева, личинок белуги на 2-3 сутки и при переходе на активное питание. Добавка в корм препарата осуществлена у личинок севрюги при переходе на экзогенное питание и годовиков осетра и севрюги. При купании раствором препарата икры севрюги более высокий процент живых зародышей в опыте (42,3) по сравнению с контролем (23,6) получен только при повторной ее обработке, а на стадии массового выклева выживаемость эмбрионов была выше в 2 раза чем в контроле. У белуги соотношение выживших личинок, перешедших на активное питание в опыте составила 58, а в контроле 47. При добавке в корм отмечена выживаемость личинок севрюги после 13 суток выращивания до 30 в опыте,против 20 в контрольном варианте. При использовании препарата в качестве добавки в корм на молодь севрюги оказывало положительное влияние на ее жизнестойкость, а у годовиков осетра и севрюги отмечено повышение пищевой поведенческой реакции. Бактерицидность тканей сразу после выклева была очень низкой и тормозила развитие микроорганизмов на 10-12 . Разницы между опытными и контрольными партиями не выявлено. Повторная обработка препаратом оказала несколько больший эффект на показатель бактерицидности тканей. Препарат Вокс оказывал на состояние внутренних органов и тканей неодинаковую реакцию. Наибольшей чувствительностью характеризовалась печень, где у годовиков осетра из контрольной группы обнаружено гистоморфологическое нарушения структуры,проявляющиеся в виде сильно выраженных инфильтратов вокруг кровеносных сосудов и портальных трактов, очагов некроза, полнокровия,стазов. Выращивание этих годовиков на корме с добавкой препарата приводило к нормализации состояния печени. Степень сформированности половых желез показывает о произошедшей анатомической дифференцировке в органах.// Аквакультура осетровых рыб Достижения и перспективы развития. Астрахань, 2004 г, с. 132-133.) Недостатком прототипа является то, что применяемый препарат Вокс не оказывает эффекта в повышении рыбоводно-биологических показателей выращиваемых рыб, отсутствуют данные о стимулировании ускоренного роста и развития выращиваемой молоди рыб, в том числе и отстающих в развитии и ослабленной молоди, не исключает заболеваемость и гибель рыб,отсутствуют гематологические показатели, не определены положительные действия на органы иммуногенеза. Задачей изобретения является разработка способа повышения иммунного статуса осетровых рыб с использованием иммуностимулирующего препарата Ронколейкин. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в иммунной коррекции организма, стимуляции ускоренного роста и развития, раннего становления, дифференцировки и развития органов иммуногенеза отстающих в развитии и повышения жизнестойкости организма ослабленных рыб. Технический результат достигается тем, что предлагаемый способ повышения иммунного статуса осетровых рыб включает купание рыб раствором иммуностимулирующего препарата, при этом обработку рыб различного возраста, роста,развития и клинического состояния, осуществляют одно или двухкратной обработкой иммуностимулирующего препарата Ронколейкин, в различных дозахв расчете на 1 г живой массы в виде одноразового купания в течение 30 минут в ванне с водой, с температурой 20 градусов,- 8,6 и принудительной аэрацией, с дальнейшим совместным содержанием опытных и контрольных рыб в общем бассейне. В настоящее время в медицине и ветеринарии терапия рекомбинантными цитокинами является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии. Ронколейкин - новый препарат группы цитокинов, обладающий широким спектром биологической активности и целенаправленным воздействием на ослабленные звенья иммунной цепи организма. В экспериментальных работах также доказана эффективность лечения ронколейкином диких,домашних, сельскохозяйственных, экзотических животных и птиц, страдающих онкологическими,бактериальными и вирусными заболеваниями. В последние годы ронколейкин,как иммуномодулирующий и иммуностимулирующий препарат, а также и антистрессант, стал успешно применяться и в аквакультуре для лечения и профилактики различной патологии и болезней рыб. Ронколеикин представляет собой прозрачную бесцветную или светло-желтого цвета жидкость. Для промышленного рыбоводства используется препарат, расфасованный во флаконы объемом 10 мл, упакованные по одному. Во флаконе объемом 10 мг содержится ронколейкина 2 мг - 2 000 000 ,5 мг - 5 000 000 и 10 мг - 10 000 000 Препарат применяют и в виде расфасованного в ампулы. В ампуле содержится рекомбинантного интерлейкина -2 0,05 мг (50 000 ), 0,1 мг (100000), 0,25 мг (250 000 ) и 0,5 мг (500 000 ). В одной упаковке по три ампулы. Ампулы имеют маркерную полосу синего цвета и кольцо излома. Ронколейкин рекомендуется хранить при температуре от 2 до 10 С. При соблюдении условий хранения препарат годен в течение двух лет с момента изготовления,допускается транспортировка при комнатной температуре в течение двух недель. Ронколейкин (во флаконах) можно использовать в течение 10-14 дней, набирая его в необходимом объеме стерильным шприцом через прокол в резиновой пробке. Приготовленный раствор(разведенный препарат) не теряет своей активности при температуре от 4 до 10 С в течение 72 часов Карповым ронколейкин рекомендуется вводить внутрь опрыскиванием корма в дозе 2 500 МЕ/кг массы рыбы трехкратно с интервалом 48 часов. Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. В опыте с сеголетками оссева (гибриды осетра и севрюги), в возрасте 3 месяцев, развивающиеся вполне нормально, со средней живой массой 25,0 г,использована доза ронколейкина 33 на 1 г живого веса рыб. В течение 1 месяца после опыта средняя живая масса рыб достигла 61,5 г и общий прирост живого веса у них составил 36,5 г. Отдельные экземпляры набрали живой вес до 80 г. У рыб контрольной группы средний вес составил только 45,0 г против начальнного 22,0 г. Пример 2. В опыте с специально отобранными,отстающими в росте и развитии сеголетками сибирского осетра в возрасте 6 месяцев, со средней живой массой 20,5 г, (контрольные рыбы весили в среднем 29 г.) ронколейкин давали в дозе 38 . За 1 месяц после опыта средняя живая масса рыб возросла до 66,4 г, то есть выросла на 45,9 г, в то же время как, контрольные рыбы прибавили лишь 23,7 г и имели средний вес 52,7, хотя имели абсолютно одинаковые условия содержания и кормления с опытной группой. При повторной обработке ронколейкином в дозе 61 на 1 г живого веса опытные рыбы, набравшие после первого опыта живую массу менее 75,0 г,стали значительно быстрее расти. Результаты(Табл.), полученные через три месяца от начала опытов показали значительную разность между подопытными и контрольными рыбами. Особи,подвергнутые воздействию ронколейкина набрали среднюю живую массу 115,3 г, прибавив 94,9 г к первоначальному 20,1 г. Среди контрольных рыб, не 3 подвергнутых к воздействию ронколейкина нередко были замечены ослабевшие, исхудалые. Средняя навеска контрольных рыб к концу работы достигла 74,7 г, то есть они прибавили в весе всего 45,7 г. Таблица Линейно-весовые данные опытных осетровых рыб опытов 1 2 3 Белуга опыт контроль Бестер опыт контроль 6 7 Опыты, также с отобранными отсталыми в росте и развитии, в возрасте 28 дней личинками белуги с массой 175 мг и длиной тела 24 мм и бестера(гибрид белуги и стерляда) с массой 150 мг и длиной тела 20 мм, проводили в дозе ронколейкина 300/ г живого веса. За месячный опытный период, с содержанием в условиях бассейнов,хорошие рыбоводные показатели имели личинки обоих видов. Личинки белуги и бестера набрали среднюю живую массу соответственно 9500 г и 7900 г. Контрольные группы рыб имели показатели соответственно 205 г и 180 г живой массой и 36 г и 27 г длины тела в начале опыта достигли результатов в конце опытов, соответственно 9300 г и 9700 г в живой массе и 123 мм и 117 мм длины тела. Пример 3. Опыты со специально отобранными слаборазвитыми и ослабленными сеголетками сибирского осетра в возрасте 5 месяцев со средней живой массой 9,7 г проводили в дозе ронколейкина 100 на 1 г живого веса. Опытные рыбы росли очень быстро (Фиг. 1) и за один месяц после опыта набрали 60 г среднего живого веса, прибавив 51,3 г. Отдельные экземпляры весили 80 - 90 г,контрольные экземпляры имели 35 г среднего веса,против 12 г первоначального При повторной обработке, рыбы данной опытной группы,несколько отставших в живом весе (35 - 55 г), по сравнению с остальными рыбами (60 - 90 г,) дозой ронколейкина 200/ г живого веса, за следующий месячный срок значительно прибавили в массе. Общая средняя масса всех опытных рыб данной партии за 2 месяца стала 120 г, что на 110,3 г выше первоначального. Отдельные особи превысили в весе 200 г. Средняя масса контрольных рыб достигла только 76 г. Опыты с перезимовавшими в зимовальных прудах ослабленными годовиками оссева со средним живым весом 150 г проводили с дозой 4 ронколейкина 300 МЕ/г живого веса. Продолжительность опытного периода, с весны до осени, была 6 месяцев. Рыбы за это время имели прудовое содержание. К концу опыта рыбы весили в среднем 1,2 кг, что на 478 г превышает средний вес контрольных рыб. Иммунное состояние опытных и контрольных рыб определяли клиническими. патологоанатомическими, гематологическими и гистологическими исследованиями. При определении исходного иммунного состояния рыб при клиническом осмотре выявлены средняя и ниже средняя упитанность, небольшие покраснения,пропитанные желтовато-красной жидкостью у отдельных рыб на различных участках тела, серо-желтоватый оттенок в области брюшка,темно-синеватые жабры с ослаблением их лепестков. Подопытные личинки были вялые,неактивные, с некоторой слабой реакцией на внешние раздражители. Патологоанатомическими исследованиями у рыб установлены паренхиматозная дистрофия печени с переполнением желчного пузыря, гиперемия внутренних органов, сосудистые поражения жабр,желтушность слизистых оболочек, отечность головного мозга с полнокровием сосудов мозговых оболочек. В мазках крови выявлено большое количество бластных клеток слабо дифференцированного эритроидного ряда (Фиг. 2),увеличена доля клеток с дегенеративными изменениями, мало встречаются как гранулоциты,так и агранулоциты. Характерными изменениями белой крови оказалось лимфопения и сдвиг ядра влево у нейтрофилов. Гистологическими исследованиями выявлено значительное уменьшение числа лимфоцитов в селезенке,кроветворные ткани головной почки располагаются рыхло, клетки в них отодвинуты друг от друга,образуют только небольшие скопления, в печени имеет место дискомплексация балок (Фиг. 3) и дистрофические изменения зернистого и жирового характера. Полученные показатели свидетельствует о задержке гемопоэза и резкой лейкопении,характеризующие слабое исходное иммунное состояние исследуемых рыб. Иммунное состояние организма всех групп подопытных рыб показали,в основном,аналогичные результаты. При клиническом осмотре рыб (опытные личинки подверглись только клиническому осмотру) выявлена большая активность, прыгучесть,вышесредняя упитанность. Опытные рыбы, на протяжении всего периода опыта,были подвижными, бодрыми, оставались здоровыми с быстрым нарастанием живого веса и не подвергались к заболеваниям и гибели. Кожа цела,слизь на поверхности умеренная, прозрачная. Нет участков кровоточивости, отсутствуют раны,экземы, язвы. Глаза блестящие, жабры розовокрасные, жаберные лепестки крепко сидят на основе, кожа цельная, блестящая, мышцы упругие. Патологоанатомическое вскрытие свежеуснувших рыб на внутренних органах заметных изменений не выявили. В брюшной полости нет постороннего содержимого. Серозные и слизистые покровы гладкие, блестящие. Органы имеют обычную форму, естественную окраску, умеренную плотность. Поверхность разрезов гладкие, сухие. Отсутствуют паразиты, их личинки и их следы. При гематологических исследованиях заметен ускоренный темпдифференциации клеток эритроидного ряда,из которых хорошо представлены эритроциты. Они созревшие,овальной и округлой формы, с большими ядрами,хорошо заметной перинуклеарной зоной. В поле зрения микроскопа чаще встречаются оксифильные и полихроматофильные нормобласты, указывающие на резкое усиление эритропоэза в организме. Много также базофильных нормобластов. Количество лимфоцитов заметно возросшее, представлены большие, средние и малые лимфоциты (Фиг. 5). Достаточное количество,палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов. Гистологическая картина органов рыб опытной группы значительно отличается от таковой у контрольных рыб. Иммунно-кроветворные органы печень, почки и селезенка приобретают выраженные морфологические структуры. Почечные канальцы и сосудистые клубочки хорошо выражены, тесно расположены между собой. Между извитыми канальцами находятся значительное количество клеток крови. Эпителиальную выстилку канальцев образуют кубические клетки с центрально расположенным округлым ядром. Лимфоциты располагаются густым слоем с ясно выраженной темно-синей структурой. Среди лимфоцитов лежит довольно большое количество эритроцитов. Зерна гемосидерина в органе мало и представлены незначительными размерами. Картина печени выражена умеренно плотным расположением балок(Фиг. 6), отсутствием сосудистых изменений. В желчных протоках эпителиальная выстилка хорошо сохранена. В селезенке лимфоциты располагались густым слоем, распределены равномерно и имели ясно выраженную морфологию. Проведенными испытаниями препарата Ронколейкин установлено достаточно хорошее иммуностимулирующее влияние препарата ронколейкина на организм осетровых рыб. Применение препарата способствует быстрому увеличению живой массы подопытных рыб по сравнению с контрольными. При этом достигается полная сохранность всего опытного поголовья рыб. Под воздействием ронколейкина в организме рыб происходят значительные иммунные преобразования, мобилизованы клеточные и гуморальные звенья защиты иммунитета,стимулирован гемопоэз и активизированы обменные процессы. Наибольшую эффективность препарат оказывает в дозах 100, 200 и 300 на 1 г живого веса рыб. Применение препарата в ванне с водой,для повышения жизнестойкости выпускаемых в естественные водоемы осетровых рыб, имеет возможность, стать в будущем, промышленным методом обработки рыб большими партиями. Таким образом,применение заявляемого способа обеспечивает следующие преимущества- стимулирует ускоренный рост и развитие выращиваемой молоди рыб- стимулирует быстрый рост отстающей в развитии и ослабленной молоди рыб-способствует раннему становлению,дифференцировки и развитию органов иммуногенеза и других органов и тканей организма-значительно улучшает иммунное состояние организма рыб. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения иммунного статуса осетровых рыб, включающий купание рыб в растворе иммуностимулирующего препарата,отличающийся тем, что рыб одно- или двухкратно обрабатывают иммуностимулирующим препаратом Ронколейкин на 1 г живой массы в виде одноразового купания в течение 30 минут в ванне с водой, с температурой 20 С,8,6 и принудительной аэрацией