Способ получения антиатеросклеротического и гиполипидемического средства “Атеролид” из полыни беловатой Artemisia leucodes Schrenk

(51) 61 9/20 (2009.01) 61 36/00 (2009.01) 61 36/282 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 2009/0601.1 29.04.2009 15.11.2010, бюл.11 Адекенов Сергазы Мынжасарович 1) Предварительный патент РК 16816, 2006 2).,,. . . . ., 333,1301-1307, 1995 3),-, ..,,. //103,926-933, 2001(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОГО И ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО СРЕДСТВА АТЕРОЛИД ИЗ ПОЛЫНИ БЕЛОВАТОЙ(57) Изобретение относится к области биоорганической химии, фармацевтической химии и технологии лекарств и касается способа получения препарата из растительного сырья, обладающего антиатеросклеротической и гиполипидемической активностью. Целью изобретения является разработка способа получения антиатеросклеротического и гиполипидемического препарата Атеролид,действующее начало которого составляет сесквитерпеновый лактон леукомизин. Технический результат заявляемого изобретения достигается тем, что используются экологически безопасный способ получения экстракта полыни беловатой с выходом сесквитерпенового лактона леукомизина 0,54 в пересчете на воздушно-сухое сырье,включающий измельчение сырья,экстракцию жидким диоксидом углерода (СО 2) при давлении 150 бар, температуре 60 С, в течение 3 часов, выделение сесквитерпенового лактона леукомизина из полученного экстракта на препаративной установке -5000 (быстрый центробежный хроматограф распределения , Франция), его перекристаллизацию и сушку,получение субстанции препарата Атеролид. Препарат Атеролид не имеет побочных эффектов и хорошо переносится больными,обладает выраженным антиатеросклеротическим и гиполипидемическим эффектом. 23091 Изобретение относится к области биоорганической химии, фармацевтической химии и технологии лекарств и касается способов получения препаратов из растительного сырья, обладающих антиатеросклеротической и гиполипидемической активностью. Задачей изобретения является разработка способа получения антиатеросклеротического и гиполипидемического препарата Атеролид,обусловленного наличием действующего веществасесквитерпенового лактона леукомизина (1). Близким аналогом является способ получения сесквитерпенового лактона гвайанового типа 2 оксо-5,7,6,11(Н)-гвай-1(10),3(4)-диен-6,12 олида, включающий использование лекарственного сырья полыни беловатой, которую сушат и измельчают, затем экстрагируют этанолом при 60 С,полученный экстракт обрабатывают водным спиртом (соотношение вода-спирт 12). После осаждения балластных веществ водно-спиртовый слой экстрагируют на делительной воронке хлороформом, хлороформный слой отгоняют на ротационном испарителе, а остаток подвергают хроматографическому разделению на оксиде алюминия. Элюированием колонки бензолом выделяют леукомизин в виде кристаллического вещества. Выход сесквитерпенового лактона леукомизина составляет 0,16 в пересчете на воздушно-сухое сырье (Предпатент РК 16816 от 15.11.2005 г. Адекенов СМ., Талжанов Н.А.,Аксартов 2-оксо-5,7,11(Н)-гвай 11(10),3(4)-диен-6,12-олид, снижающий синтез холестерина триглицеридов и липопротеинов низкой плотности). Недостатками вышеописанного способа являются 1. низкий выход целевого вещества (0,16) 2. использование токсичного растворителябензола, применение которого в фармацевтическом производстве запрещено по международным стандартам . Одним из аналогов но назначению является препарат Правастатин, применяемый при лечении атеросклероза.,,. . .. . . , 333,1301-1307 (1995),,..,(2001). При применении правастатина возможно развитие побочных эффектов в виде изменения функции печени с повышением уровня трансаминаз,диспепсии, головной боли, кожной сыпи, изменения в мышцах с появлением болей. В качестве растительного сырья в предлагаемом нами способе используют надземную часть полыни беловатой (.), которая широко распространена на территории Южного Казахстана,эксплуатационный запас сухой надземной массы составляет 28 т с объемом ежегодных заготовок 11,6 т. Технический результат заявляемого изобретения достигается тем, что используются экологически безопасный способ получения экстракта Польши беловатой с выходом сесквитерпенового лактона леукомизина 0,54 в пересчете на воздушно-сухое сырье,включающий измельчение сырья,экстракцию жидким диоксидом углерода СО 2 при давлении 150 бар, температуре 60 С, в течение 3 часов, выделение сесквитерпенового лактона леукомизина из полученного экстракта на препаративной установке -5000 (быстрый центробежный хроматограф распределения , Франция), его перекристаллизацию и сушку,получение субстанции препарата Атеролид. Способ получения сесквитерпенового лактона леукомизина включает две стадии 1 - экстракцию сырья полыни беловатой сжиженным диоксидом углерода на сверхкритической экстракционной установке 2 - выделение сесквитерпенового лактона леукомизина из полученного экстракта на препаративной установке -5000 (быстрый центробежный хроматограф распределения , Франция), его перекристаллизация и сушка. Стадия 1 - экстракция сырья полыни беловатой сжиженным диоксидом углерода при сверхкритических условиях. Надземную часть полыни беловатой измельчают на ножевой мельнице для до 2-5 мм. 4,5 кг измельченных листьев и цветочных корзинок полыни беловатой загружают в экстрактор УЭ-1 (ООО Горо-Инжиниринг, Россия, по лицензии австрийской компании). Экстракцию полыни полыни беловатой проводят в разных режимах при давлении от 100 до 300 бар,температуре от 50 до 60 С, в течение 3 часов(таблица 1). После проведения экстракции определяют количественное содержание леукомизина в СО 2 экстрактах полыни беловатой методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе 1100 в изократическом режиме в следующих условиях-состав подвижной фазы ацетонитрил - вода в соотношении 11-детектирование при длине волны 254 нм-объем вводимой пробы 20 мкл. Обработку проводят с использованием программного обеспечения . Поставленная цель предлагаемого изобретения достигается при продолжительности экстракции полыни беловатой 3 часа, давлении 150 бар,температуре 60 С. Данный способ обеспечивает сравнительно высокий выход СО 2-экстракта полыни беловатой 5,11 в пересчете на воздушно-сухое сырье, и количественное содержание целевого продукта - сесквитерпенового лактона леукомизина составляет 17,0 в пересчете на массу СО 2 экстракта полыни беловатой. Таблица 1 Экстракция травы полыни беловатой сжиженным диоксидом углерода Наименование способа образца Способ 1 Способ 2 Способ 3 Способ 4 Способ 5 Способ 6 СО 2-экстракт полыни беловатой СО 2-экстракт полыни беловатой СО 2-экстракт полыни беловатой СО 2-экстракт полыни беловатой СО 2-экстракт полыни беловатой СО 2-экстракт полыни беловатой Содержание Содержание леукомизина леукомизин ав г Стадия 2 - выделение леукомизина из полученного экстракта на препаративной установке-5000, его перекристаллизация и сушка. 30,0-70,0 гр. (точная навеска) СО 2-экстракта полыни беловатой количественно переносят в стеклянный стакан объемом 1,0 л и растворяют в смеси подвижной фазы и стационарной фазы. Пробу закачивают в ротор препаративной установки 5000 при помощи насоса со скоростью 100 мл/мин в течение 5-8 минут. Объем вводимой пробы 500-800 мл. Для подбора оптимальных параметоров выделения сесквитерпенового выделения сесквитерпенового лактона леукомизина из СО 2 экстракта полыни беловатой разделение проводят на установке -5000 (таблица 2). Фракции отбирают при помощи фракционного коллектора,переключением вентилей направления потока,согласно получаемой хроматограмме при появлении первого пика (через 40-50 мин) переключают вентиль 1 и собирают первую фракцию в течение 1 минуты, при появлении следующего пика переключают вентиль 2 и собирают вторую фракцию в течение 3-4 минут, при выходе пика леукомизина переключают вентиль 3 и собирают третью фракцию в течение 10-16 минут,переключают вентиль 4 и собирают четвертую фракцию до окончания выхода пробы (показание детектора 0-2 ). Таким образом, в результате разделения получают 4 фракции объемом от 50 до 800 мл. По окончании разделения скорость подачи мобильной фазы снижают до 10 мл/мин и выключают ротор. Фракции, обогащенные леукомизином (фракции 3), упаривают на ротационном испарителе 05. После отгона растворителя получают кристаллический остаток(леукомизин технический), который перекристаллизовывают. Фракции,не содержащие леукомизин,упаривают на ротационном испарителе 05 . Отдельно собирают остатки фракции 1, фракции 2, фракции 4 и передают для анализа на наличие леукомизина. 23091 Таблица 2 Выделение сесквитерпенового лактона леукомизина из СО 2-экстракта полыни беловатой на установке-5000 способа Вводимая проба Условия Выход обогащенной Выход субстанции разделения фракции, г леукомизина, г ( в пересчете на масса объем, мл , , мл/ кол-во массу СО 2 экстрак- соотноше- нм мин оборотов экстракта) та, г ние ротора в СФ/ПФ мин Способ 1 30 500 254 100 1000 16,8 г (масло с 3,6 (12,00)(200/600) кристаллами)Примечание СФ - стационарная фаза, ПФ - подвижная фаза Для подготовки стационарной и подвижной фазы смешиваем 7 л гептана, 7 л ацетонитрила и 3,5 л этилацетата, получаем 11,5 л подвижной фазы и 6 л стационарной фазы Леукомизин технический подвергают перекристализации. Испарительную колбу со 100 гр. леукомизина технического устанавливают на водяную баню при температуре 80-90 С и растворяют в 1,0 л этанола. Этиловый спирт добавляют постепенно до момента полного растворения леукомизина. Чтобы снизить потери спирта, используют обратный холодильник. После полного растворения леукомизина колбу снимают с водяной бани и постепенно охлаждают(сначала при комнатной температуре 1 час, затем в холодильнике при 2-5 С - 1 час). При этом в колбе постепенно начинают выпадать кристаллы леукомизина игольчатой формы. Леукомизин сушат сначала на фильтре под вытяжной вентиляцией в течение 2 часов, а затем переносят в фарфоровую чашку и сушат их в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40 С и давлении - 0,08-0,091 мРа до постоянной массы. Леукомизин имеет вид игловидных кристаллов белого цвета без запаха. Качественный анализ субстанции леукомизина проводят методом обращенно-фазовой ВЭЖХ высокого давления на приборе 1100 в изократическом режиме при условиях указанных выше на стр. 4 Обработку данных проводят с использованием программного обеспечения . Количественный выход сесквитерпенового лактона леукомизина достигается следующим образом 70,0 гр. (точная навеска) СО 2-экстракта полыни беловатой количественно переносят в стеклянный стакан объемом 1,0 л и растворяют в 4 600 мл подвижной фазы и 200 мл стационарной фазы, проба закачивается в ротор препаративной установки -5000 при помощи насоса со скоростью 100 мл/мин в течение 8 минут, объем вводимой пробы 800 мл, разделение проводится при скорости подачи мобильной фазы 50 мл/мин и скорости вращения ротора 1000 оборотов/мин,полное разделение вводимой пробы происходит в течение 1,5 часа, УФ-детектирование при 254 нм. Выход целевого вещества с чистотой не менее 97,0 леукомизина составляет 14,0 в пересчете на массу СО 2-экстракта полыни беловатой (таблица 2). А при пересчете на воздушно-сухое сырье выход сесквитерпенового лактона леукомизина составляет 0,54. Полученную субстанцию в дальнейшем используют для приготовления таблетированной формы препарата Атеролид. Для получения таблетированной формы антиатеросклеротического и гиполипидемического препарата Атеролид субстанцию леукомизина смешивают с вспомогательными веществами лактоза, крахмал картофельный, кальция стеарат. Таблетки Атеролид 0,25 г содержат в своем составе субстанцию леукомизина - 0,03 г 0,01 (12) лактозу - 1,195 г 0,01 (78) крахмал картофельный - 0,0225 г 0,01 (9) кальция стеарат - 0,0025 г 0,01 (1). Влияние леукомизина на синтез основных фракций липидовизучают на культуре свежевыделенных изолированных гепатоцитов кролика. 23091 Гепатоциты выделяют методом двухступенчатой перфузии кальцийсодержащим раствором с 0,05 коллагеназой типа. Леукомизин вводят в культуру клеток в виде спиртового раствора в концентрации 10, 50 и 100 мкг/мл, время инкубации 5 суток. Правастатин вводят в тех же концентрациях в виде водного раствора. Леукомизин при введении в культуру клеток оказывает угнетающее действие на синтез основных фракций липидов гепатоцитами (таблица 3). Уровень холестерина в культуральной среде значительно ниже контрольной серии, причем леукомизин оказывает обратный дозозависимый эффект (доза 10 мкг/мл оказывает больший эффект,чем 100 мкг/мл) и превосходит эффективность препарата сравнения правастатина (0,250,06 ммоль/л и 0,430,04 ммоль/л соответственно). Таблица 3 Основные показатели липидного обмена после 5 дней инкубации (концентрация суспензии 6,5 млн. кл/мл) Препарат Доза, мкг/мл Холестерин,Триглицериды, моль/л ммоль/л Контроль 0,610,08 5,290,8 Леукомизин 10 0,250,06 5,720,6 50 0,340,08 5,40,5 100 0,420,09 4,960,3 Правастатин 10 0,530,04 2,50,1 50 0,470,05 6,20,3 100 0,430,04 5,50,4 Влияние леукомизина на синтез основных фракций липидовна модели изучают алиментарной гиперлипидемии на крысах. Гиперлипидемию индуцируют ежедневным пероральным введением холестерина (1 г/кг) и холата натрия (0,1 г/кг) в виде суспензии в кукурузном масле в течение 2 месяцев. Затем на фоне диеты перорально крысам вводят леукомизин в дозах 1 и 10 мг/кг и контроль - препарат Правастатин в дозе 2 мг/кг в течение 1,5 месяцев. По окончании эксперимента определяют концентрацию основных фракций липидов в сыворотке крови стандартными методами (таблица 4). Таблица 4 Уровень липидов в сыворотке крови Холестерин,Липопротеины Липопротеины ммоль/л низкой плотности высокой плотности Установлено, что в отношении синтеза холестерина проявляется дозозависимый эффект,снижение его уровня более выражено при введении леукомизина в дозе 10 мг/кг (3,10 ммоль/л 0,46 против 3,810,56 ммоль/л для препарата правастатина). В отношении триглицеридов концентрация их при дозе 1 мг/кг в 2 раза ниже, чем при введении правастатина (0,580,22 ммоль/л и 1,60,27 ммоль/л соответственно). Концентрация общих липидов при введении леукомизина ниже, чем при введении правастатина. Влияние леукомизина на концентрацию липопротеинов низкой плотности ниже, чем правастатина. Леукомизин в экспериментеипоказывает выраженный гиполипидемический эффект и превосходит по эффективности действия препарат сравнения провастатин. Клинические исследования препарата Атеролид проводились на 65 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) на базе НИИ кардиологии и внутренних болезней (г. Алматы) в соответствии с международными требованиями клинических испытаний. Все больные получают стандартное этиопатогенетическое лечение, в качестве гиполипидемической терапии используют Атеролид (содержащий 30 мг действующего вещества леукомизина) по 1 таблетке 3 раза в день в течение двух месяцев (1 группа - 35 человек). В контрольной группе (30 человек) больные получают плацебо. Критерием эффективности препарата Атеролид является положительная динамика показателей липидного спектра критериями безопасности - хорошая переносимость препарата,отсутствие токсического влияния препарата на организм больных по результатам лабораторных показателей. В таблице 5 показана оценка клинических проявлений в группе больных, получавших в 5 23091 комплексном лечении Атеролид (1 группа) и в группе больных, получавших плацебо (группа 2). Как видно из таблицы 5, такие критерии, как приступы загрудинных болей,артериальная Таблица 5 Сравнительная оценка выраженности клинических проявлений в двух группах исследования Стенокардия АртериальОдышка Отеки Нарушение ная гипертосна ния До лечения 1 группа 922,4 608,3 680,3 375,5 428,9 2 группа 932,8 649,7 560 346,9 348,7 Через 1 1 группа 469,9 409,7 528,9 208,0 329,9 мес. 2 группа 886,5 529,9 529,9 329,6 306,4 Через 2 мес. 1 группа 146,9 208,0 146,9 187,6 122,5 2 группа 288,9 346,3 208,0 286,4 285,4 В ходе проведенного клинического испытания у больных изучается гемограмма до приема исследуемого препарата, а также через два месяца после приема (таблица 6). При сопоставлении исследуемых показателей общего анализа крови до и после лечения в обеих группах больных достоверно значимых изменений не выявляется. В общем анализе мочи у больных с ИБС изменений не было как при поступлении, так и при выписке. Показатели креатинина, которые отражают функциональную способность почек, у больных до лечения составляет 79 мкмоль/л, после лечения-74,5 мкмоль/л. Общий билирубин до лечения составляет 14,2 мкмоль/л, через два месяца лечения - 11,3 мкмоль/л. Таблица 6 Сравнительная характеристика показателей общего анализа крови в группах больных, принимавших Атеролид и плацебо Атеролид Показатель До приема препарата Через 2 месяца приема Гемоглобин (г/л) 132,86,1 140,14,8 Лейкоциты (х 109 г/л) 6,91,1 5,62,2 СОЭ (мл/ч) 72,2 6,21,4 Эритроциты (х 1012 г/л) 4,01,3 4,351,2 Плацебо Показатель Гемоглобин (г/л) 127,86,1 128,14,8 Лейкоциты (х 109 г/л) 6,71,4 5,01,1 СОЭ (мл/ч) 81,2 6,52,1 Эритроциты (х 1012 г/л) 3,50,3 3,70,5 Проведена оценка показателей липидного обмена у больных основной и контрольной групп (таблица 7). Как видно из таблицы 7, уровень холестерина и триглицеридов (ТГ) достоверно снижается у больных, принимавших Атеролид в течение двух месяцев. В то время как у больных, получавших плацебо, уровень холестерина практически не изменяется по сравнению с исходными данными. Также в значительной степени Атеролид снижает уровень атерогенных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Таблица 7 Сравнительная оценка показателей липидного обмена у больных с ИБС получавших Атеролид и плацебо Показатели Холестерин, ммоль/л Триглицериды,липопротеины липопротеины ммоль/л низкой плотности высокой плотности(ЛПНП),(ЛПВП),ммоль/л ммоль/л Атеролид плацебо Атеролид плацебо Атеролид плацебо Атеролид плацебо(30) До лечения 6,80, 1 5,60,2 1,80,01 0,950,2 4,370,2 3,80,4 1,30,1 1,30,2 Через 2 5,20,2 5,70,3 1,20,02 1,00,04 3,650,1 3,20,2 1,20,1 1,20,1 месяца лечения Примечание -достоверность различий до и после лечения при р 0,001 23091 Таким образом, прием препарата Атеролид в течение двух месяцев существенно снижает уровень холестерина, триглицеридов и ЛПНП у больных с ишемической болезнью сердца. Препарат Атеролид при дозе 1 таблетка 3 раза в день в течение двух месяцев приема не оказывает токсического влияния на организм больных. Преимущества способа получения антиатеросклеротического и гиполипидемического средства Атеролид из полыни беловатой1. Доступность растительного сырья-полынь беловатая , которая широко распространена на территории Южного Казахстана,эксплуатационный запас сухой надземной массы составляет 28 т с объемом ежегодных заготовок 11,6 т 2. Способ получения субстанции антиатеросклеротического и гиполипидемического средства Атеролид из полыни беловатой является экологически безопасным, так как исключается применение в процессе производства токсических растворителей 3. Впервые разработан способ выделения индивидуального сесквитерпенового лактона леукомизина с применением препаративной центробежной распределительной хроматографии,позволяющая выделять с чистотой не менее 97,0 сесквитерпенового лактона леукомизина с выходом 0,54 в расчете на воздушно-сухое сырье 4. Препарат Атеролид не имеет побочных эффектов и хорошо переносится больными,обладает выраженным антиатеросклеротическим и гиполипидемическим эффектом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения антиатеросклеротического и гиполипидемического средства на основе сесквитерпенового лактона леукомизина,включающий измельчение, экстракцию сырья полыни беловатой -,отличающийся тем,что извлечение из растительного сырья проводят жидким диоксидом углерода - СО 2, при давлении 150 бар, температуре 60 С, в течение 3 часов, а сесквитерпеновый лактон леукомизин из полученного экстракта выделяют на препаративной установке -5000. 2. Антиатеросклеротическое и гиполипидемическое средство на основе субстанции сесквитерпенового лактона леукомизина, при следующем соотношении компонентов на одну таблетку массой 0,25 г леукомизин